公开(公告)号
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CN1300172C
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公开(公告)日
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2007.02.14
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申请(专利)号
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CN200310113790.6
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申请日期
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2003.11.25
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专利名称
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一种抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体
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主分类号
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C07K16/10(2006.01)I
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分类号
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C07K16/10(2006.01)I;A61K39/395(2006.01)I;A61K9/12(2006.01)I;A61K9/08(2006.01)I;A61K9/10(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I;A61P11/00(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
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发明(设计)人
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王希良;杜新安;石辛甫;张松乐;刘建源;李 岩;赵光宇;田 光;周 华
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地址
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100071北京市丰台区东大街20号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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北京太兆天元知识产权代理有限责任公司
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代理人
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张 韬
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国省代码
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北京;11
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主权项
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一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体,其特征在于该抗体是由如下制备方法制成的:1)灭活纯化的SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹,免疫四次、间隔10天免疫一次,试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800,测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800,并且不同的SARS-CoV标准毒株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性;2)采集马抗SARS-CoV血浆,用无热源2倍蒸馏水稀释加入21%饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G,用无热源蒸馏水恢复原体积再用30%饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG,先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9%氯化钠盐水用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,超滤液为纯化的马抗SARS-CoV IgG;3)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58℃、30min,用帆布过滤去Fc段,滤液为初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;4)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基疏水层析柱Phenyl Sepharose 6 Fast Flow,用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱,20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液,再用截留分子量为6万的超滤器超滤除盐、浓缩,得纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体;其中灭活纯化的SARS-CoV由如下方法制得:1)绿猴肾细胞的复苏、培养,取细胞种子库冻存Vero细胞株,用DMEM培养基并加入10%小牛血清培养,提供培养SARS-CoV的Vero细胞;2)SARS冠状病毒滴定,对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV,扩增培养SARS-CoV,采用组织培养测定SARS-CoV病毒的毒力,其半数感染量为106-108,对滴定的SARS-CoV分装冻存;3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV,用无血清DMEM培养SARS-CoV,生产SARS-CoV;4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液,反复冻融三次,-37℃冰冻或不冻融,收集SARS-CoV细胞培养液;5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯,4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV,取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代,检测SARS-CoV灭活效果;6)灭活的SARS-CoV培养液,4℃、离心12000rpm 30min,弃沉淀杂蛋白,上清为SARS-CoV液;7)用截留分子量为30万的超滤柱超滤SARS-CoV液,浓缩和去杂蛋白,滤液为粗制灭活的SARS-CoV;8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱,开始缓冲液是0.1MPBS PH7.0缓冲液,用100mM PBS PH7.0洗脱,收集SARS-CoV,合并浓缩收集初步纯化的SARS-CoV;9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析,用100mM PB,PH7.2液平衡并将病毒吸附在柱上、用100mM PB,PH7.2,0.35M NaCl洗脱,收集SARS-CoV峰,合并浓缩收集纯化的SARS-CoV;10)纯化灭活的SARS-CoV分装放-70℃保存。
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摘要
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本发明涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体,特征在于该抗体为马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体,同时本发明公开该抗体的制备方法。本发明抗体能特异消灭SARS-CoV,对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果。
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国际公布
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