| 公开(公告)号 | CN1268643C |
| 公开(公告)日 | 2006.08.09 |
| 申请(专利)号 | CN200310113791.0 |
| 申请日期 | 2003.11.25 |
| 专利名称 | 一种抗SARS-CoV IgY抗体及其制备方法 |
| 主分类号 | C07K16/18(2006.01)I |
| 分类号 | C07K16/18(2006.01)I;C07K16/02(2006.01)I;A61K39/395(2006.01)I;A61K9/19(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I;A61P11/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 |
| 发明(设计)人 | 王希良;杜新安;石辛甫;张松乐;赵光宇;田 光;刘士山;朱和平;周 华 |
| 地址 | 100071北京市丰台区东大街20号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 北京太兆天元知识产权代理有限责任公司 |
| 代理人 | 张 韬 |
| 国省代码 | 北京;11 |
| 主权项 | 一种特异性鸡抗SARS-CoV的IgY抗体，其特征在于该抗体是由如下方法制备的：1)纯化的灭活SARS-CoV抗原与等量不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，经胸肌及大腿内侧肌肉免疫检疫的育龄来亨鸡母鸡，间隔10天免疫一次，共免疫3次，免疫前后当提纯的鸡蛋黄抗体对流电泳效价达1∶64、间接ELISA抗体效价达1∶6400以上收集鸡蛋；2)生产抗SARS-CoVIgY抗体的鸡，每间隔一个月再用纯化灭活SARS-CoV抗原与福氏不完全佐剂加强免疫，收集抗体鸡蛋；3)弃蛋壳、蛋清及卵黄膜，取出卵黄与蒸馏水按1∶8稀释，充分混匀后4℃过夜，取上清液离心，再弃沉淀及上层脂质，取中层清液加入19％固体硫酸钠，45℃水浴，充分溶解再离心；沉淀溶于适量蒸馏水，6万超滤柱超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，滤液为纯化的鸡抗SARS-CoVIgY抗体，制备喷雾剂型及冻干制品；其中步骤1)中所用纯化的灭活SARS-CoV抗原按如下步骤制备：A、绿猴肾细胞的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；B、SARS冠状病毒滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量测定SARS-CoV的毒力106-108，对滴定的SARS-CoV分装冻存；C、SARS-CoV感染Vero细胞生产SARS-CoV，用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV；D、Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次，冰冻-37℃或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；E、向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；F、灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；G、用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；H、对粗制灭活SARS-CoV上SepharoseCL-2B分子筛纯化，对粗制灭活SARS-CoV上SepharoseCL-2B柱层析，0.01Mtris-HClPH7.4缓冲液洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；I、对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化，用0.03MNacl、50mMTrisPH8.0缓冲液洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；J、对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；K、对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；L、对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。 |
| 摘要 | 本发明的公开一种新型的用于治疗、预防SARS-CoV的鸡抗SARS-CoV IgY抗体蛋，同是本发明公开一种新型的用于治疗、预防诊断SARS-CoV的鸡抗SARS-CoV IgY抗体。本发明抗体能特异消灭SARS-CoV，对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果。 |
| 国际公布 |
