| 公开(公告)号 | CN1746302A |
| 公开(公告)日 | 2006.03.15 |
| 申请(专利)号 | CN200510044079.9 |
| 申请日期 | 2005.07.18 |
| 专利名称 | 利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法 |
| 主分类号 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/52(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 山东大学 |
| 发明(设计)人 | 祁庆生;苏移山;王 鹏 |
| 地址 | 250100山东省济南市山大南路27号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 济南圣达专利商标事务所 |
| 代理人 | 郑华清 |
| 国省代码 | 山东;37 |
| 主权项 | 一种利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，由下述步骤组成(1)重组表达载体的构建：克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC3.5.1.52)基因，经酶切后插入大肠杆菌载体，命名为vector-PNG；然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，经酶切后插入到vector-PNG载体；与N-糖酰胺酶基因形成融合基因，载体命名为vector-PNG-A；vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的酵母表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k--PNG-A；(2)重组酵母菌株的构建：用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；(3)分泌糖蛋白的重组菌株的构建：将糖蛋白基因插入到pPIC9K载体的α-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有糖蛋白基因分泌表达载体；用SacI将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体，转化到上述构建的表面表达N-糖酰胺酶的重组酵母菌株基因组中，构建成分泌表达目的蛋白的酵母重组工程菌株；通过G418抗生素筛选出阳性克隆菌株；(4)糖蛋白在酵母中诱导表达：将上述阳性克隆工程菌株，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分，培养28～35小时；5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，培养36-60小时；将N-糖酰胺酶表达于酵母细胞壁表面，同时外源糖蛋白分泌表达到培养介质中；在培养介质中，表面表达的N-糖酰胺酶将分泌表达的糖蛋白的糖链切除，生成了非N-糖基化蛋白；其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液；其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；其中，上述重组阳性克隆工程菌株可以通过离心、过滤去除。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，即利用分子生物学技术构建含有N-糖酰胺酶和目的蛋白基因的表达载体，并通过电转化法转入酵母菌中，N-糖酰胺酶稳定表达在酵母细胞表面，目的蛋白经分泌表达到培养介质中，在分泌和培养过程中，表面表达的N-糖酰胺酶将分泌表达的目的糖蛋白的糖链除去，从而获得经过真核表达系统分泌的非N-糖基化蛋白。利用本发明的方法获得的蛋白经过真核蛋白的后处理加工，具有正确的构像和三级结构，但不具有酵母蛋白的N-糖基化，若作为蛋白药物不会在人体内产生免疫源性；也不会因为过糖基化使表达蛋白失去活性。 |
| 国际公布 |
