| 公开(公告)号 | CN1238522C |
| 公开(公告)日 | 2006.025 |
| 申请(专利)号 | CN02155058.1 |
| 申请日期 | 2002.12.20 |
| 专利名称 | 白细胞介素－2及其基因在戒毒应用中的测试方法 |
| 主分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分类号 | C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61K38/20(2006.01)I;A61P25/36(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 中国科学院上海生命科学研究院 |
| 发明(设计)人 | 刘新恒;顾锦法;王晋慧;姚明忠 |
| 地址 | 200031上海市岳阳路319号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 上海新天专利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 国省代码 | 上海;31 |
| 主权项 | 白细胞介素-2IL-2及其基因在戒毒应用中的测试方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)真核表达质粒pcDNA3-IL-2的构建人IL-2基因经EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接头的全长含信号肽的人IL-2cDNA462bp克隆入经相同酶切的pcDNA3载体Invitrogen，IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，构建的质粒转化入大肠杆菌JM109扩增，碱裂解法制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化，通过测定260nm的光吸收来确定质粒浓度，注射时质粒稀释于含5％葡萄糖的磷酸缓冲液中；(2)重组腺病毒Ad5-IL-2的构建人IL-2基因经EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接头的全长含信号肽的人IL-2cDNA462bp克隆入经相同酶切的pCA13载体Microbix，得到pCA13-IL-2，此时IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，pCA13-IL-2与腺病毒基因组质粒pBHG10Microbix共转染293细胞，进行同源重组，筛选重组腺病毒，扩增纯化腺病毒，注射时病毒稀释于含5％蔗糖的PBS中；(3)吗啡依赖小鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖小鼠模型，此组小鼠为吗啡依赖组，吗啡依赖小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组小鼠为吗啡戒断组；(4)吗啡依赖大鼠模型的建立以剂量递增法形成吗啡依赖大鼠模型，此组大鼠为吗啡依赖组，吗啡依赖大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1可激发戒断症状，此组大鼠为吗啡戒断组；(5)IL-2蛋白及pcDNA3质粒介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾小鼠模型，在末次给吗啡3小时后，将成瘾的小鼠随机分为8组，每组10只，蛋白治疗组：经第5与第6腰椎之间，蛛网膜下腔，分别注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IUIL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的0.01M磷酸缓冲液，IL-2基因治疗组：8μgpcDNA3/8μglipofectamine，对照组，提前24小时注射，8μgpcDNA3-IL-2/8μglipofectamine，基因治疗组，提前24小时注射，注射总体积为10μl，注射后5分钟，各组小鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠吗啡戒断症状测试方法的建立用剂量递增法建立的吗啡成瘾大鼠模型，在末次给吗啡3小时后，将成瘾的大鼠随机分为4组，每组5-11只，经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内，蛛网膜下腔，分别注射2×104，4×104，1.4×105IUIL-2蛋白，对照组为含5％葡萄糖的PB，注射总体积为30μl，注射后5分钟，各组大鼠腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发戒断症状，观察大鼠的各种戒断症状，如湿狗样抖动、异常姿势、激惹、咬牙、腹泻、流涎、体重减少，并计算戒断症状总评分值；(7)腺病毒载体介导IL-2基因抑制小鼠吗啡戒断症状测试方法的建立大鼠经第5与第6腰椎之间插入导管鞘内，蛛网膜下腔，分别注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型Ad5，1×107pfuAd5-IL-2，注射总体积为10μl，注射后一周测定腹腔注射纳洛酮4mg.kg-1激发的戒断症状，观察小鼠开始跳跃的潜伏期、15分钟内小鼠出现的跳跃次数及30分钟内小鼠的体重变化；(8)成瘾性试验a.小鼠竖尾试验：小鼠随机分为六组，每组10只，分别腹腔注射吗啡20mg.kg-1阳性对照，腹腔注射含5％葡萄糖的PB阴性对照，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛网膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU，观察给药后2小时内小鼠有无出现S形竖尾反应；b.小鼠跳跃反应试验：小鼠随机分为三组，每组10只，分别皮下注射含5％葡萄糖的PB阴性对照组或吗啡阳性对照组，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次，9:00、10:00、11:00、13:00、15:00，第二天注射2次9:00、11:00，吗啡组小鼠起始剂量为2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1剂量递增；IL-2蛋白组剂量为1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU，于最后一次给药后2小时，腹腔注射纳洛酮10mg.kg-1，观察10分钟内小鼠跳跃反应次数；(9)统计方法采用单因素方差分析。 |
| 摘要 | 本发明属基因工程技术领域。本发明公开了一种白细胞介素-2(IL-2)及其基因在戒毒应用中的测试方法。通过本发明的方法表明蛛网膜下腔注射IL-2蛋白有较好的戒毒作用，其效果呈剂量依赖性。pcDNA3-IL-2基因也有一定的戒毒作用，通过对该基因导入条件的进一步优化，其戒毒效果可望更好，更适合实际实用。 |
| 国际公布 |
