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公开(公告)号
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CN1238512C
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公开(公告)日
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2006.01.25
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申请(专利)号
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CN200310112672.3
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申请日期
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2003.12.18
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专利名称
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结缔组织生长因子C区抗原的制备方法
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主分类号
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C12N15/63(2006.01)I
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分类号
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C12N15/63(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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东南大学
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发明(设计)人
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刘乃丰;吴国球
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地址
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210096江苏省南京市四牌楼2号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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南京经纬专利商标代理有限公司
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代理人
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王之梓
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国省代码
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江苏;32
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主权项
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一种结缔组织生长因子C区抗原的制备方法，其特征在于第一步：用NheI和XbaI酶对pCOMB3载体进行双酶切，切除两酶切位点NheI和XbaI之间的272bp条带后的载体用T4DNA连接酶自连后转化大肠杆菌JM109，然后，以质粒pET-28(a)+作模板，分别以p1：5’-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’及p2：5’-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’为上、下游引物，PCR扩增后，可见550bp条带的扩增产物，回收该条带，并将回收的条带与被切除272bp后的pCOMB3载体连接，经转化JM109后筛选得到阳性质粒pKM；第二步：用组织贴壁法进行人内皮细胞原代培养，用50mmol/L葡萄糖修饰的牛血清白蛋白对原代培养后的内皮细胞干预8h，0.125％胰蛋白酶消化后，用Trizol法提取RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入：双蒸H2O31.5μl，10×Taqbuffer5μl，10mol/LdNTP1μl，浓度为25pmol/μl的引物p3：5’CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，p4：5’-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，浓度为0.65μg/μl的cDNA模板10μl，浓度为5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置于PCR仪扩增，扩增条件：94℃5min变性，94℃1min，65℃30sec，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保温，再用SpeI和XhoI酶对PCR产物与阳性质粒pKM分别进行双酶切后，用T4DNA连接酶使两个片段通过粘性末端相连，转化大肠杆菌JM109，从中获得阳性质粒pKMc1；第三步：将含阳性质粒pKMc1的大肠杆菌JM109单菌落扩增后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃诱导3h，得到含有结缔组织生长因子C区242-349位氨基酸的大肠杆菌，超声破碎细胞，用镍离子树脂亲和层析获得结缔组织生长因子抗原。
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摘要
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结缔组织生长因子抗原的制备方法，对pCOMB3载体双酶切，切除272bp条带后的载体用T4 DNA连接酶自连后转化大肠杆菌，以pET-28(a)+作模板扩增，回收550bp条带，将其与切除后的pCOMB3载体连接，经转化后筛选得阳性质粒；对人内皮细胞原代培养，用牛血清白蛋白对其干预8h，胰蛋白酶消化，用Trizol法提取RNA，合成cDNA，在1.5ml管中加入：ddH2O 31.5μl，10×Taqbuffr5μl，10mol/L dNTP 1μl，25pmol/μl的引物，0.65μg/μl的cDNA模板10μ1，5U/μl的TaqPlus0.5μl，94℃5min变性，94℃1min，65℃30sec，72℃1min，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保温下扩增，对PCR产物与阳性质粒双酶切后，用T4DNA连接酶相连两个片段，转化大肠杆菌JM109，得pKMc1；将pKMc1的大肠杆菌单菌落扩增，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃诱导3 h，得大肠杆菌，超声破碎，层析得结缔组织生长因子抗原。
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国际公布
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