| 公开(公告)号 | CN1712547A |
| 公开(公告)日 | 2005.12.28 |
| 申请(专利)号 | CN200510037778.0 |
| 申请日期 | 2005.02.01 |
| 专利名称 | 甲胎蛋白(AFP)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒 |
| 主分类号 | C12Q1/68 |
| 分类号 | C12Q1/68;C12Q1/25 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 合肥中科大生物技术有限公司 |
| 发明(设计)人 | 魏海明;田志刚;程 民;王宗贵 |
| 地址 | 230027安徽省合肥市金寨路96号科大西区生命科学学院 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 合肥华信专利商标事务所 |
| 代理人 | 余成俊 |
| 国省代码 | 安徽;34 |
| 主权项 | 甲胎蛋白(AFP)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征为：它包含细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；以上各种溶液所用溶剂均为水；(1)、细胞裂解液I包含0.1mol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水；(2)、细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)、水；(3)、RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(4)、RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(5)、无RNA酶的水制备方法为：向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，20min高压，室温放置备用。(6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的；(7)、反转录缓冲液包含9.1μmol/LOligo(dT)12-18、3.6U/μlRnaseInhibitor、72.7mmol/LDTT(二硫苏糖醇)、182mmol/LTris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/LKCl、1lmmol/LMgCl2、水；(8)、逆转录酶储存液包含20mmol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、100mmol/LNaCl、0.1mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidetp-40、200U/μl逆转录酶(M-MLV)、水；(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液，pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L；(10)、PCR反应液包含18.5mmol/LTris-HCI(pH8.3，25℃)、2.78mmol/LMgCI2、92.6mmol/LKCl、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μlTaq酶、dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，其浓度均为400nmol/L)、水；上下游引物序列分别为：P1：5’-TGACTCCAGTAAACCCTGGT-3’P2：5’-AGAAATCTGCAATGACAGCC-3’(11)、探针为荧光标记探针，其序列为：5’-FAM-TGCTGCACTTCTTCATATGCCAACA-TAMRA-3’探针的浓度为：2μmol/L，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(12)、标准品的序列为：1AGAAATCTGCAATGACAGCCTCAAGTTGTTCCTCTGTTATTTGTGGCTTT51TGCTTCACAAGGTTAATGAGAAACTCTTGCTTCATCGTTTGCAGCGCTAC101ACCCTGAGCTTGGCACAGATCCTTATGGAAAATGAACTTGTCATCAGAGA151ATGCAGGAGGGACATATGTTTCATCCACCACCAAGCTGCTGAAGCATGGC201CTCCTGTTGGCATATGAAGAAGTGCAGCACTGGCCAACACCAGGGTTTAC251TGGAGTCA标准品的浓度为：106copies/μl，TE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，水)溶解；(13)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品，阳性对照品为有AFPcDNA的样品(104copies/μl，TE溶解)，阴性对照品为正常人外周血总RNA的反转录产物。 |
| 摘要 | 本发明涉及一种甲胎蛋白(AFP)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包含总RNA提取液(细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II和无RNA酶的水)，反转录反应液，dNTP混合物，逆转录酶，PCR反应液，探针，阳性标准品，对照品。本发明通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中AFP的mRNA的表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中检测肿瘤患者的外周血、骨髓、淋巴结及癌组织中AFP mRNA的表达，为原发性肝癌的早期诊断、转移、复发、治疗方案的确定及预后的判断提供重要的参考依据。 |
| 国际公布 |
