| 公开(公告)号 | CN1683413A |
| 公开(公告)日 | 2005.10.19 |
| 申请(专利)号 | CN200510038083.4 |
| 申请日期 | 2005.03.11 |
| 专利名称 | 基因工程法制备抗乙肝病毒特异性转移因子的方法 |
| 主分类号 | C07K16/10 |
| 分类号 | C07K16/10;C12N15/09 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 扬州同人生物工程有限公司 |
| 发明(设计)人 | 叶满红;郭金钢 |
| 地址 | 225100江苏省扬州市邗江区杨庙镇东首 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 扬州市锦江专利事务所 |
| 代理人 | 江平 |
| 国省代码 | 江苏;32 |
| 主权项 | 基因工程法制备抗乙肝病毒特异性转移因子的方法，其特征在于包括以下步骤：一、mRNA差异显示法克隆小鼠抗乙肝病毒特异性转移因子基因取健康成年雌性BALBc小鼠，人工感染乙肝病毒，感染成功后，取出其脾脏组织，用DEPC处理的生理盐水冲洗后迅速投入液氮中，待冷冻完全即可用于提取脾脏组织mRNA；脾脏组织总RNA的提取采用PromegaRNAgents总RNA提取系统，取脾脏组织于变性剂中使组织匀浆化，用酸平衡的苯酚∶氯仿∶异戊醇＝125∶24∶1进行抽提，使RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相，再用异丙醇将RNA沉淀浓缩；所得RNA用1-2个单位的无RNA酶污染的DNA酶处理，然后60-70℃加热8-12分钟，使DNA酶失活，mRNA溶解于双蒸水中，零下65-75℃保存；采用PromegaPolyATtract-mRNA提取系统进行mRNA的抽提，在分离用磁架的作用下，杂交复合物被抗生链霉素蛋白包裹磁珠捕捉，随后洗去非结合的RNA，使mRNA和核糖体RNA分离；再利用AMV反转录酶将mRNA反转录成cDNA第1条链，反转录以3’端的单碱基锚定引物引导下进行；然后以聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离扩增条带，银染法显示差异表达mRNA，在PCR过程中3’端锚定引物和5’端随机引物与反转录产物共同在低温下退火，所得产物经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，筛选特异性mRNA目的条带；将特异性mRNA条带进一步扩增、鉴定、杂交后克隆、测序、筛选；二、重组基因工程酵母菌的构建对筛选所得的小鼠抗乙肝病毒特异性转移因子基因进行质粒构建：通过PCR方法使小鼠抗乙肝病毒特异性转移因子基因中带有XhoI和XbaI酶切位点序列，再克隆到表达载体pPICZ中；将重组表达载体克隆进入啤酒酵母菌中，培养重组酵母菌30-40小时后，0.5％甲醇诱导40-45小时大规模表达抗乙肝病毒特异性转移因子；三、基因工程表达产物的分离与纯化提取抗乙肝病毒特异性转移因子的细胞；将细胞破碎，分离，去除固体物质，留上清，再纯化即可获得抗乙肝病毒特异性转移因子。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种以基因工程法制备抗乙肝病毒特异性转移因子的方法，首先以mRNA差异显示法克隆小鼠抗乙肝病毒特异性转移因子基因；然后构建表达抗乙肝病毒特异性转移因子的重组酵母菌，并培养，大规模表达抗乙肝病毒特异性转移因子，经破碎、分离和纯化即可获得抗乙肝病毒特异性转移因子。本发明可进行大规模的工业化生产，其生产成本低，产量大，可制成抗乙肝病毒的药品和保健品等。 |
| 国际公布 |
