公开(公告)号
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CN1212404C
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公开(公告)日
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2005.07.27
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申请(专利)号
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CN02110068.3
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申请日期
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2002.02.07
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专利名称
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一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法
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主分类号
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C12P17/02
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分类号
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C12P17/02;//(C12P17/02,C12R1:01)
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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山东大学
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发明(设计)人
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李越中;胡玮;刘新利;韩冠君
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地址
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250100 山东省济南市山大南路27号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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济南三达专利事务所
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代理人
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孙君
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国省代码
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山东;37
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主权项
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一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法,该方法具体步骤顺序如下:(1)发酵菌株的选择:粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)ATCC15384;(2)粘细菌菌株在保持代谢产物合成能力前提下,液体培养均匀生长的驯化:将上述菌株接种在固体斜面培养基上,固体培养基成分为:大豆蛋白胨5~15g/L,马铃薯淀粉15~25g/L,CaCl2.2H2O1g/L,MgSO4.7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L,琼脂粉15g/L;30℃,培养5天后,接种至液体发酵培养基,液体发酵培养基成分为:大豆蛋白胨5~15g/L,马铃薯淀粉15~25g/L,CaCl2.2H2O1g/L,MgSO4.7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L;30℃,120转/分摇床培养5~7天,将上述培养菌重新接回至固体培养基培养,依原条件培养后再接种至液体发酵培养基,如此重复传代驯化,在95~100代时,培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长,表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态,同时细胞生长的代时缩短,生长量提高,达到最大细胞量的时间由原来的10~12天,缩短至5~7天,获得的最大细胞量由原来的1~4×108细胞/ml,增加到5~10×109细胞/ml;(3)发酵培养条件的优化:将步骤(2)均匀化生长的菌株接种至固体培养基,固体培养基成分同上,30℃,培养5天后,接种至含有树脂的液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为:碳源是地瓜淀粉、马铃薯淀粉、葡聚寡糖、木聚糖之一,浓度均为20g/L,氮源是水解乳蛋白、大豆蛋白胨、酒石酸铵、柠檬酸铵之一,浓度均为10g/L,CaCl2.2H2O1g/L,MgSO4.7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L,树脂选择XAD-16,添加量为20ml/L;发酵容器为500ml三角瓶,内含200ml液体发酵培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120转/分,培养5~7天;(4)综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响:将上述菌株接种至固体培养基,固体培养基成分同上,30℃,培养5天后,接种至含有树脂的液体发酵培养基,液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉20g/L,水解乳蛋白10g/L,CaCl2.2H2O1g/L,MgSO4.7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L,树脂选择XDA,AB-8或混合树脂之一,添加量为10~40ml/L;发酵容器为500ml三角瓶,内含200ml液体发酵培养基,培养温度为30℃,摇床转速为120转/分,培养6~7天;上述混合树脂是指CD180,CAD-40,XDA,S-8,NKA-II,AB-8六种树脂按重量比0.8~1.2∶0.8~1.2∶1.8~2.2∶0.8~1.2∶2.8~3.2∶1.8~2.2混合;(5)埃博霉素A的分离提取纯化:发酵结束后,将液体发酵培养基中添加的树脂取出,经甲醇浸提,浸提物再经过离子交换,分子筛和高效液相提取纯化,即得到埃博霉素A。
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摘要
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本发明公开了一种提高粘细菌次级代谢产物产量的方法,即提高粘细菌中埃博霉素(Epothilone)产生菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)的代谢产物埃博霉素A产量的方法。该方法包括1)对成团生长的粘细菌液体均匀生长的驯化方法,2)适合埃博霉素A产生的地瓜淀粉、水解乳蛋白等的选定以及3)综合地消除产物代谢积累的混合树脂添加方法等步骤,从而使得埃博霉素A产物的产量达到62.7mg/L的水平。
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国际公布
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