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公开(公告)号
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CN1654647A
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公开(公告)日
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2005.08.17
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申请(专利)号
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CN200510048963.X
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申请日期
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2005.01.13
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专利名称
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利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法
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主分类号
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C12N15/09
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分类号
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C12N15/09;C12N15/10;C12N15/12;C12N15/866;C12P21/02;C07K1/14
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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浙江大学
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发明(设计)人
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吴小锋;姚慧鹏;曹翠平
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地址
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310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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杭州求是专利事务所有限公司
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代理人
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林怀禹
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国省代码
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浙江;33
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主权项
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利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法，其特征在于：(1)LF基因的克隆：以人乳腺组织cDNA为模板，PCR基因扩增技术获得人LF基因，引物设计如下：正向引物：5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位点；反向引物：5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性50秒；30个循环，55℃退火30秒，70℃延伸2分钟；最后1个循环，70℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，获得全长为2136bp的LF基因，随后将LF基因克隆入3.9kb载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆LF基因顺序正确性；(2)含有人LF基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa获得重组体pBlueBacHisa-LF；通过共转染在昆虫细胞内与构建的杂交杆状病毒HyNPVDNA发生同源重组产生重组病毒，共转染的方法为：1μgpBlueBacHisa-LFDNA和15μgHyNPVDNA混合，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf21培养细胞，先用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒原液，用来筛选重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml，将此重组病毒命名为HyNPV-LF；(3)家蚕体内表达和重组LF纯化：使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒HyNPV-LF进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；将幼虫的血淋巴作为重组人LF纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴：在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边；用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO450mmol/L，NaCl0.5mol/L，pH8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白，结果表明获得的重组LF非常纯一，从每头家蚕获得的产量为400μg。
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摘要
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本发明公开了一种利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法。利用申请人构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体，构建了含有人LF基因的重组病毒。利用家蚕作为重组病毒的宿主，表达、生产了重组人LF。解决了LF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点。家蚕幼虫体内表达的重组人LF大部分分泌在家蚕血淋巴中，非常有利于蛋白质的快速提取，利用亲和层析法纯化了重组的LF，从每头家蚕获得的产量高达400μg。利用基因工程技术用家蚕作为表达载体可以大量生产重组LF，为它在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。
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国际公布
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