一种同时检测对虾白斑综合症和托拉综合症病毒的核酸点杂交方法

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公开(公告)号	CN1197977C
公开(公告)日	2005.04.20
申请(专利)号	CN03119088.X
申请日期	2003.05.19
专利名称	一种同时检测对虾白斑综合症和托拉综合症病毒的核酸点杂交方法
主分类号	C12Q1/68
分类号	C12Q1/68;C12P19/34;G01N33/569
分案原申请号
优先权
申请(专利权)人	中国科学院武汉病毒研究所
发明(设计)人	石正丽;袁军法
地址	430071 湖北省武汉市武昌小洪山
颁证日
国际申请
进入国家日期
专利代理机构	武汉宇晨专利事务所
代理人	王敏锋
国省代码	湖北;42
主权项	一种同时检测对虾白斑综合症和托拉综合症病毒的核酸点杂交方法，包括下列步骤：(1)制备试剂盒：包括病毒核酸探针、样品处理液、杂交液，封闭液、抗地高辛抗体、洗涤液、显色剂、阳性对照、阴性对照、1.5ml离心管、杂交膜、杂交袋、研磨小棒；(2)探针的制备：地高辛探针和生物素探针的制备用常规PCR方法，将对虾白斑综合症和托拉综合症病毒PCR产物分别标记上地高辛和生物素，扩增引物设计来自对虾白斑综合症探针的序列，上游引物ACCACAATGACCGTAAGG；下游引物TGTACCTACAAGAGTGATTGG和托拉综合症病毒探针的序列，上游引物：AACGCGCATTGCTTCTTTT；下游引物：TCCTCCACTGGTTGTTGTAT；扩增模板来自对虾白斑综合症和托拉综合症病毒核酸；(3)样品处理：称取样品，放入1.5ml的离心管内，加入样品处理液，用研磨小棒研磨直至组织被研碎，调pH至7.5，低速离心后取上清，用TN缓冲液按1∶10稀释，95℃处理10min并放置冰上；(4)预杂交和杂交：将杂交膜放入杂交袋内，加入预杂交液使杂交膜被溶液覆盖，封闭好杂交袋，在42℃预杂交1-4小时，然后杂交袋内加入探针杂交液，42℃杂交过夜；(5)洗涤：将杂交膜放在干净的平皿内，用洗涤液在室温条件下洗涤2次，将杂交膜重新放回干净的杂交袋内，加入洗涤液在68℃洗涤2次，每次15min；(6)封闭：弃洗涤液，加入1％封闭液，室温下孵育30min；(7)抗体抗原反应：用缓冲液稀释抗地高辛抗体和生物素抗体，放入杂交袋内，37℃下孵育30min；(8)洗涤：取出杂交膜放在干净的平皿内，用缓冲液在室温下连续洗涤2次；(9)显色：用缓冲液配置显色底物，将杂交膜放在干净的杂交袋内，放入显色底物覆盖杂交膜，在避光处显色，肉眼观察结果，显棕色为阳性反应；(10)终止反应：弃显色液，加终止液，并以缓冲液漂洗，记录结果；(11)再度显色：用缓冲液配置显色底物，将杂交膜放在干净的杂交袋内，放入显色底物覆盖杂交膜，避光显色，肉眼观察结果，仅感染WSSV为蓝紫色，同时感染两种病毒的阳性结果为棕色和蓝紫色的叠加；(12)终止反应：弃显色液，加终止液，记录结果。
摘要	本发明公开了一种同时检测对虾白斑综合症和托拉综合症病毒的核酸点杂交方法，其步骤是：首先是探针的制备；其次是样品处理；第三是预杂交和杂交；第四洗涤；第五是封闭；第六是抗体抗原反应；第七是洗涤；第八是两步显色反应；最后终止反应。本发明能同时检测两种病毒，灵敏度高，成本低，适合于对虾白斑综合症和托拉综合症病毒的诊断以及亲虾、幼苗和成虾的健康状态检测。
国际公布