| 公开(公告)号 | CN1556216A |
| 公开(公告)日 | 2004.12.22 |
| 申请(专利)号 | CN200410012604.4 |
| 申请日期 | 2004.01.02 |
| 专利名称 | 蓝舌病毒的检测方法及试剂盒 |
| 主分类号 | C12Q1/04 |
| 分类号 | C12Q1/04;C12Q1/68 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 武汉大学 |
| 发明(设计)人 | 董长垣;桂亦瑞;张芄玮;陈冬峨;刘 军 |
| 地址 | 430072湖北省武汉市武昌珞珈山 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 武汉宇晨专利事务所 |
| 代理人 | 王敏锋 |
| 国省代码 | 湖北;42 |
| 主权项 | 一种蓝舌病毒的检测方法，其步骤是：A、细胞的培养及病毒的增殖，采用含有10％的小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10μl/ml谷氨酰胺、MEM培养基培养Vero细胞，待细胞单层覆盖达80％培养瓶底时，弃去培养液，用pH7.2的PBS洗涤，接种病毒悬液，28-37℃吸附，弃去病毒悬液，加入含有0-2％小牛血清的MEM维持培养基，37℃培养，出现细胞病变时，收获病毒；B、待测样品PCR模板的制备，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病毒基因组dsRNA，让待测样品通过样品处理溶液处理，成为待检模板：一种是来自动物待检样品BTVdsRNA模板的制备：首先是取待检肝素抗凝全血加入PBS缓冲液，轻柔悬浮血细胞，离心，沉淀用PBS缓冲液洗涤；其次是收集沉淀，于沉淀中加入由异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基磺酸钠、β-巯基乙醇组成的裂解液，混匀至液体清亮；第三是加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，静置；第四是离心，取上清至管中；第五是于上清液加入等体积异丙醇和1/10体积的3mol/LNaAc溶液，放置；第六是离心，沉淀用75％乙醇洗涤，溶解于焦碳酸二乙酯DEPC处理的水，即为待检模板，用于RT-PCR扩增；另一种是来自细胞培养BTVdsRNA模板的制备：首先是培养20-36hr的带毒单层细胞加入上述相同的裂解液，待溶液清亮后，吸取并移至Ep管中；其次是加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇，混匀，冰浴；第三是离心，取上层水相，移入Ep管中；第四是加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/LNaAc溶液，沉淀，离心，弃上清；第五是用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，沉淀干燥，沉淀用DEPC处理的水溶解，保存；C、待检样品dsRNA逆转录合成cDNA：在反应试管分别加入待检病毒样品模板dsRNA提取液，正义引物P1和反义引物P2，94-96℃变性7-9分钟，冰浴5分钟，向混合物中加入10×逆转录缓冲液、dNTP和M-MLV逆转录酶，混匀，37℃孵育60-80分钟，72℃2-4分钟灭活逆转录酶，保存；D、聚合酶链式反应，在反应试管中依次加入：10×PCR缓冲液、MgCl2、正义引物P1、反义引物P2、dNTPs、cDNA、无菌水、TaqDNA聚合酶，混匀反应体系，离心后，覆盖灭菌液体石蜡，反应管放入DNA扩增仪中，预变性94-96℃2-4分钟，变性94-96℃28-32秒，退火50℃28-30秒，延伸72℃42-46秒，共30-36个循环，产物DNA延伸补齐72℃7-9分钟；阳性对照试管和阴性对照试管处理同上；E、检测结果：a.用双蒸水配制TAE缓冲液，取一定量于一烧杯，加入琼脂糖，加热使之溶解，浇制电泳平板，亦用TAE缓冲液作电泳缓冲液；b.吸取反应管中的下层液体，点样，按电压降5V/cm电泳15-30分钟，在紫外灯下观察分析结果，出现与阳性对照平齐的DNA带即判读为阳性。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种蓝舌病毒的检测方法及试剂盒，首先是细胞的培养及病毒的增殖；其次是通过在反应试管中加入样品处理液，制备待测样品和阴阳性对照物PCR模板；第三是通过在反应试管中分别加入待检病毒样品模板和逆转录反应溶液，以逆转录合成待检样品dsRNA的cDNA；第四是通过在反应试管中加入PCR反应体系，进行聚合酶链反应，扩增合成靶标序列。本发明检测准确、敏感、廉价、安全，操作方便，易于推广。 |
| 国际公布 |
