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您现在的位置: 医学全在线 >> 药学理论 >> 中国药品专利文献 >> 正文:重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法专利检索:专利号/专利人/发明人
    

重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法

公开(公告)号 CN1132844C  
公开(公告)日 2003.12.31  
申请(专利)号 CN98103307.5  
申请日期 1998.07.24  
专利名称 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法  
主分类号 C07K14/54  
分类号 C07K14/54;C12N1/21;//C12N1/21,C12R1:19  
分案原申请号  
优先权  
申请(专利权)人 吴光耀  
发明(设计)人 吴光耀;刘祚昌  
地址 100091北京市圆明园西路北京大学燕北园303楼406号  
颁证日  
国际申请  
进入国家日期  
专利代理机构 北京北新智诚知识产权代理有限公司  
代理人 佩兰  
国省代码 北京;11  
主权项 一种重组人白细胞介素-18(IL-18)工程菌直至产物的制备方法,其特征在于它包括以下几个步骤:①人外周血中白细胞的分离;②白细胞中总mRNA的分离;③人工合成含有限制性内切酶切点的引物,在合成的上游引物中导入EcoRI位点,在合成的下游引物中导入BamHI位点,其引物的序列为:PL5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′PR3′GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′④RT-PCR基因扩增:在含有合成引物的存在下,以mRNA为模板,通过RT-PCR基因扩增,获得IL-18基因片段,其核苷酸序列和相应的基酸序列为:10ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGAM Y F G K L E S K L S V I R20AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGGN L N D Q V L F I D Q G N R30 40CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AATP L F E D M T D S D C R D N50GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGCA P R T I F I I S M Y K D S60 70CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAGQ P R G M A V T I S V K C E80AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTTK I S T L S C E N K I I S F90AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGTK E M N P P D N I K D T K S100 110GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AATD I I F F Q R S V P G H D N120AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTAK M Q F E S S S Y E G Y F L130 140GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAAA C E K E R D L F K L I L K150AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTTK E D E L G D R S I M F T V158CAA AAC GAA GAC TAAQ N E D *⑤IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化:经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接,并转化至感受态的大肠杆菌中,经抗性培养基筛选,得阳性克隆的大肠杆菌,即IL-18工程菌。⑥将工程菌扩增培养,热激表达、破壁、破包含体;IL-18纯化。  
摘要 一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌及其产物的制备方法,包括人白细胞分离,白细胞总mRNA分离;人工合成含有限制性内切酶切点的引物;RT-PCR基因扩增;IL-18 cDNA克隆;转化进入大肠杆菌;工程菌中产物高效表达;IL-18的纯化。由于采用含有限制性内切酶切点的引物,准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因。使用大肠杆菌偏爱的终止密码子提高表达率、采用高扩增培养基,表达量高,使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。  
国际公布  
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