高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
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公开(公告)号
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CN1236071C
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公开(公告)日
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2006.01.11
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申请(专利)号
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CN200410006374.0
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申请日期
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2004.03.01
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专利名称
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高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
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主分类号
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C12Q1/68(2006.01)I
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分类号
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C12Q1/68(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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中国中医研究院中药研究所
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发明(设计)人
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黄璐琦;冯成强;唐晓晶
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地址
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100700北京市东直门内南小街16号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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代理人
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国省代码
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北京;11
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主权项
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一种高特异性聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别真伪乌梢蛇的方法，其特征在于包括DNA模板提取、PCR扩增、电泳检测三个步骤；①模板DNA的提取：选取无霉变和虫蛀的药材肌肉部分1g，置于研钵中经液氮速冻后研成粉末，将粉末速转移至50mL离心管中，加入6mL已灭菌的匀浆缓冲液，匀浆缓冲液由蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl10mmol/LPH＝8.0，Na2EDTA1mmol/LPH＝8.0组成，加入蛋白酶K至终浓度为150μg/mL，再加入10％SDS至终浓度为0.8％；55℃水浴3-4小时，其间轻摇数次，取出冰浴至4℃，400g离心5分钟，取上清液，加入等体积Tris饱和酚抽提，混匀10分钟，两相成乳状，5000g离心15分钟，取上层水相，重复一次，再用CHCl3抽提两次，CHCl3抽提离心后取上层水相加入两倍无水乙醇沉淀DNA，-20℃冰箱中过夜；第二天取出，5500g离心15分钟，沉淀物用70％乙醇洗涤两次，室温挥干乙醇，用适量TE溶解DNA，-20℃备用；②PCR扩增：PCR反应体系30μl含10mmol/lTris-HClPH＝8.0，50mmol/lKCl，0.1％TritonX-100，1.5mmol/lMgCl2，1.5mmol/1dNTPs，两种高度特异性鉴别引物HWL-1即5’-GCGAAAG-CTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’和HWH-1即5’-CAGGCTCCTCTA-GGTTGTTATGGGGTACCG-3’，各10pmol/L，DNA模板约100ng，反应在PTC-100基因扩增仪上进行扩增；循环参数：95℃预变性4分钟；95℃变性40秒，65℃退火1分钟，72℃延伸30秒；10个循环；95℃变性40秒，60℃退火1分钟，72℃延伸30秒；15个循环；72℃延伸5分钟；③电泳检测：PCR实验中设置无模板DNA的阴性对照，反应完成后，取5μL反应液经溴化乙锭染色，1.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察，在310bp-320bp范围内处扩增出明亮唯一条带的样品即为正品乌梢蛇，混淆品均应无任何条带出现。
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摘要
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本发明是利用DNA分子遗传标记技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法。设计了一对高特异性鉴别引物，通过高特异性聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别中药材乌梢蛇与市场上常见的伪品：滑鼠蛇、黑眉锦蛇、红点锦蛇、王锦蛇、赤链华游蛇、玉斑锦蛇、赤链蛇、灰鼠蛇、眼镜蛇、三索锦蛇。使用此方法鉴别乌梢蛇的真伪，只通过简单的乌梢蛇及其伪品的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测三步即可完成对药材真伪的鉴别。操作简单、易于掌握、准确性高。
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国际公布
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