| 公开(公告)号 | CN1324146C |
| 公开(公告)日 | 2007.07.04 |
| 申请(专利)号 | CN200510037779.5 |
| 申请日期 | 2005.02.01 |
| 专利名称 | BCR-ABL融合基因(P210bcr/ab1mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒 |
| 主分类号 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分类号 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/25(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 合肥中科大生物技术有限公司 |
| 发明(设计)人 | 程 民;魏海明;田志刚;耿 燕 |
| 地址 | 230027安徽省合肥市金寨路96号科大西区生命科学学院 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 合肥华信专利商标事务所 |
| 代理人 | 余成俊 |
| 国省代码 | 安徽;34 |
| 主权项 | BCR-ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征为：它包含细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；以上各种溶液所用溶剂均为水； (1)、细胞裂解液I包含0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水；其中0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.6； (2)、细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠、重量体积比为0.2％的十二烷基硫酸钠、水；其中0.3mol/L醋酸钠溶液pH值为5.2； (3)、RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、水；其中0.2mol/L醋酸钠溶液pH值为5.2；0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5； (4)、RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、水；其中0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5； (5)、无RNA酶的水制备方法为：向去离子水加入焦碳酸二乙酯，至体积终浓度为0.05％，22-25℃放置10-12小时后，121℃，20min高压，22-25℃放置备用； (6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的； (7)、反转录缓冲液包含9.1μmol/L Oligo(dT)12-18、3.6U/μl RNA酶抑制剂、72.7mmol/L二硫苏糖醇、182mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、273mmol/L氯化钾、11mmol/L氯化镁、水；其中182mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3； (8)、逆转录酶储存液包含20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钠、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫苏糖醇、体积比为50％的甘油、体积比为0.01％的Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶、水；其中20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5； (9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液，pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L； (10)、PCR反应液包含18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、2.78mmol/L氯化镁、92.6mmol/L氯化钾、0.37μmol/L上下游引物、0.1U/μl Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/L dGTP、400nmol/LdTTP、水；其中18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3； 上下游引物序列分别为： P1：5’-AGC ATT CCG CTG ACC ATC A-3’， P2：5’-GCG TGA TGT AGT TGC TTG GGA C-3’ (11)、探针为荧光标记探针，其序列为： 5’-FAM-TTT GGG CTT CAC ACC ATT CCC CAT TG-TAMRA-3’ 探针的浓度为：2μmol/L，TE溶液溶解，TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水。 (12)、标准品的序列为： 1 AGCATTCCGC TGACCATCAA TAAGGAAGAT GATGAGTCTC CGGGGCTCTA 51 TGGGTTTCTG AATGTCATCG TCCACTCAGC CACTGGATTT AAGCAGAGTT 101 CAAAAGCCCT TCAGCGGCCA GTAGCATCTG ACTTTGAGCC TCAGGGTCTG 151 AGTGAAGCCG CTCGTTGGAA CTCCAAGGAA AACCTTCTCG CTGGACCCAG 201 TGAAAATGAC CCCAACCTTT TCGTTGCACT GTATGATTTT GTGGCCAGTG 251 GAGATAACAC TCTAAGCATA ACTAAAGGTG AAAAGCTCCG GGTCTTAGGC 301 TATAATCACA ATGGGGAATG GTGTGAAGCC CAAACCAAAA ATGGCCAAGG 351 CTGGGTCCCA AGCAACTACA TCACGC 标准品浓度为：106copies/μl，TE溶液溶解，TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水； (13)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品，阳性对照品为有P210bcr/abl cDNA的样品，浓度为104copies/μl，阴性对照品为外周血总RNA的反转录产物。 |
| 摘要 | 本发明涉及一种BCR-ABL融合基因(P210bcr/ablmRNA)荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包含总RNA提取液(细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II和无RNA酶的水)，反转录反应液，dNTP混合物，逆转录酶，PCR反应液，探针，阳性标准品，对照品。本发明通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中P210bcr/abl的mRNA的表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中检测慢性粒细胞性白血病患者的外周血中P210bcr/ablmRNA的表达，为慢性粒细胞性白血病的早期诊断、复发、治疗方案的确定及预后的判断提供重要的参考依据。 |
| 国际公布 |
