| 公开(公告)号 | CN101016536A |
| 公开(公告)日 | 2007.08.15 |
| 申请(专利)号 | CN200610135351.9 |
| 申请日期 | 2006.12.21 |
| 专利名称 | 乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建 |
| 主分类号 | C12N5/10(2006.01)I |
| 分类号 | C12N5/10(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/51(2006.01)I;C12N15/79(2006.01)I;G01N33/53(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 福建医科大学 |
| 发明(设计)人 | 林 旭;黄清玲;柏世玉;林建银 |
| 地址 | 350004福建省福州市交通路88号福建医科大学 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | |
| 代理人 | |
| 国省代码 | 福建;35 |
| 主权项 | 一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建，其特征是： (一)试剂： p56为pUC18重组载体，含全基因组HBV DNA，HBV DNA的preS2起始密码由CTG定点突变成ATG；HepG2细胞及HepG2.2.15细胞，均以含10％小牛血清的DMEM培养； (二)构建1.2倍体HBV DNA重组真核表达载体 (1)片段A的获取 以引物TBf和TBr从质粒pSEAP2-Basic中扩增0.1Kb的TB片段Transcription Blocker，总体积为50ul，用ABI 9700 PCR扩增仪扩增，采用热启动方式，待温度上升至94℃后加入聚合酶，反应经94℃预变性2分钟后进入循环，循环结束后72℃延伸7分钟；PCR产物与0.2倍体积的6×DNA上样缓冲液混匀后上样，1.5％琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，稳压120V，电泳30分钟；在紫外灯下将含目的基因片段的琼脂糖凝胶切下，置离心管中，用胶回收试剂盒回收DNA片段，每100mg琼脂糖凝胶加入300μl Solution I，65℃水浴10分钟，每隔两分钟颠倒一次，使胶完全溶解；混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；再以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置2分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA； PCR回收产物以Sal I、BamH I酶切，反应体系20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收，该片段记为A； (2)片段B的获取 以Sap I完全酶切p56-mut，反应体系100μl，37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收3.2kb的片段即完整的全基因组HBV DNA；回收产物进行自身连接，反应体系20μl，4℃连接24h，连接产物用DNA纯化试剂盒纯化，加入250μl Solution I，混合液移入吸附柱中，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；吸附柱中加入500μl Solution II，10000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；再以solution II液重复洗柱一次；空柱10000g离心2分钟，将吸附柱置1.5ml离心管中，开盖放置3分钟使乙醇完全挥发，往吸附柱中央加入25μl灭菌双蒸水，室温静置5分钟后10000g离心1分钟洗脱DNA；获得的环状HBV DNA记为#56-mut HBV DNA，以BamH I和Xba I双酶切，反应体积20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收约2.0Kb片段，该片段记为B； (3)片段C的获取 以Xba I和Rsr II双酶切p56-mut，反应体积20μl，37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收1.3Kb片段，该片段记为C； (4)片段D的获取 用引物PC和PD从#56-mut HBV DNA中扩增0.6Kb DNA，总体积为50ul；PCR扩增条件同前，1.5％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.6Kb片段，并以Rsr II酶切，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经DNA纯化试剂盒纯化，纯化产物用SalI酶切，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约0.4Kb片段，该片段记为D； (5)pREP10载体的酶切 以Sal I切除pREP10载体上的真核表达盒相关片段，包括CMV启动子、多克隆位点、SV40加尾信号，反应体积20μl；37℃水浴16h，酶消化产物经0.75％琼脂糖凝胶电泳后胶回收试剂盒回收约8.2Kb载体片段； (6)目的片段与载体的连接及转化 以Sal I切除pREP10载体后回收的8.2Kb载体片段与A-D四个片段连接，构建重组载体pREP-HBV，反应体积30μl，4℃连接24h，将连接产物加入100μl感受态Top10细菌，冰浴30分钟，42℃热休克2分钟，快速置冰浴2分钟，加入0.8ml LB培养液，37℃、300rpm/分钟摇育45分钟；4000g离心2分钟收集细菌，将细菌涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育16小时； (7)筛选重组克隆 氨苄青霉素琼脂平板上挑取菌落，转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、300rpm/分钟摇育8小时；取1.5ml菌液用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，4000g离心2分钟收集细菌，加入250μl Solution I(25mM Tis-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)震荡重悬细菌，加入250μl Solution II(0.2N NaOH，1％SDS)，颠倒混匀至菌液变清，加入350μl Solution III(3M KAc，pH5.5)，混匀；12000g离心10分钟，上清移入吸附柱内，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入500μl SolutionIV，12000g离心1分钟，弃收集管内的液体，加入650μl SolutionV，10000g离心1分钟，弃收集管内的液体，同法重复洗柱一次，弃收集管内的液体，空柱12000g离心2分钟；在吸附柱中央加入30μl灭菌三蒸水，12000g离心1分钟洗脱质粒DNA，该质粒记为pREP-HBV； pREP-HBV质粒含A-D四个外源DNA片段：A为扩增自pSEAP2-Basic载体的TB(Transcription Blocker)片段；B、C、D共同组成1.2倍体HBV DNA，由此构成一个完整的HBV转录单位，其中B片段位于HBV基因组1402nt-249nt，其5’端含HBV的核心启动子(Basic Core promoter，BCP)，C片段位于HBV基因组249nt-1573nt，D片段位于HBV基因组1573nt-2000nt，其3’端含加尾信号；取5 |
| 摘要 | 本发明公开了一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2-RHBV的构建，属人体疾病的预防与治疗的前期研究。本发明构建能稳定表达HBV相关抗原并复制的HepG2细胞株，作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外；以HepG2-RHBV细胞株应用于抗HBV药物的筛选；以构建的HepG2-RHBV细胞株为基础，进一步研究HBV对HepG2细胞的影响。由于本发明构建HBV自主复制的肝细胞株，使HBV在HepG2细胞中不仅能长期复制、表达特异性抗原及产生病毒颗粒，而且作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外，从而研究HBV对HepG2细胞的总体影响，分析HBV的可能致病机制，为临床治疗提供指导和依据。 |
| 国际公布 |
