| 公开(公告)号 | CN100335628C |
| 公开(公告)日 | 2007.09.05 |
| 申请(专利)号 | CN200510025775.5 |
| 申请日期 | 2005.05.12 |
| 专利名称 | 分泌人干扰素－α2a的重组卡介苗及其构建方法 |
| 主分类号 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/21(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C07H21/00(2006.01)I;A61K38/21(2006.01)I;A61K39/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 上海交通大学 |
| 发明(设计)人 | 刘海涛;夏术阶;孙晓文 |
| 地址 | 200240上海市闵行区东川路800号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 上海交达专利事务所 |
| 代理人 | 毛翠莹 |
| 国省代码 | 上海;31 |
| 主权项 | 一种分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括如下步骤： 1)卡介苗穿梭表达载体的构建：分别设计编码Ag85B信号肽的基因片段和IFN-α2a的扩增引物，编码Ag85B信号肽的基因片段的上下游酶切位点分别为BamHI和EcoRI，IFN-α2a的上下游酶切位点分别为EcoRI和SalI，经聚合酶链式反应分别合成编码Ag85B信号肽的基因片段和IFN-α2a基因片段，将编码Ag85B信号肽的基因片段克隆到pMV261载体中，得到pMS，再将IFN-α2a基因片段与pMS载体编码Ag85B信号肽的基因片段连接，得到穿梭表达载体pMSIFN-α2a； 2)卡介苗的培养：选取卡介苗为上海丹麦株，将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，液体培养基含有10％的营养剂ADC、0.5％吐温80和0.2％甘油，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期，OD600值＝0.6，制得感受态卡介苗； 3)电转化技术构建重组卡介苗rBCGIFN-α2a：在一离心管中混匀400μl含1×108cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达载体pMSIFN-α2a，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数：电压为2500V，电容为25μF，电阻为1000Ω，阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGIFN-α2a，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养； 4)重组卡介苗rBCGIFN-α2a的鉴定与功能检测：进行抗酸染色初步确定rBCGIFN-α2a为抗酸杆菌，抽提rBCGIFN-α2a质粒DNA后，PCR扩增得到IFN-α2a的基因片段，WesternBlot检测到rBCGIFN-α2a培养上清中和菌体中有IFN-α2a蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGIFN-α2a培养上清中有高含量的IFN-α2a。 |
| 摘要 | 本发明涉及一种分泌人干扰素-α2a的重组卡介苗及其构建方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽片段和人IFN-α2a的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSIFN-α2a，然后采用电穿孔技术将pMSIFN-α2a导入BCG构建重组卡介苗rBCGIFN-α2a，依靠pMSIFN-α2a在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌IFN-α2a。本发明得到的重组卡介苗rBCGIFN-α2a具有BCG和IFN-α2a的双重效果，能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤；利用重组卡介苗rBCGIFN-α2a在膀胱腔内的局部协同作用减少BCG和外用IFN-α2a的用量，可以克服BCG治疗的毒副作用。 |
| 国际公布 |
