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公开(公告)号
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CN101063123A
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公开(公告)日
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2007.10.31
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申请(专利)号
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CN200710020890.2
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申请日期
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2007.04.17
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专利名称
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人C-型利尿钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品
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主分类号
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C12N15/09(2006.01)I
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分类号
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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江南大学
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发明(设计)人
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金 坚;张莲芬;陈 伟;李 洁;许正宏;雷楗勇;窦文芳;史仲平
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地址
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214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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无锡市大为专利商标事务所
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代理人
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时旭丹;刘品超
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国省代码
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江苏;32
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主权项
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人C-型利尿钠肽CNP与人血清白蛋白HSA的融合蛋白的制备方法，其特征是从人血管内皮细胞中提取RNA，通过RT-PCR反转录得到CNPcDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA；用重叠PCR技术，连接HSAcDNA和CNPcDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CNPcDNA融合基因插入到克隆载体，HSA-CNPcDNA融合基因在宿主系统进行表达，HSA-CNPcDNA融合基因被整合到宿主的染色体中； (1)CNPcDNA的克隆： 以RT-PCR反转录得到的CNPcDNA第一链为模板，通过PCR扩增出CNPcDNA，所用的引物如下： p1：5’CGGAATTCCACCATGCATCTCTCCCA-3’ p2：5’AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCT-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，CNPcDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环35次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-CNP，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-CNP； (2)HSAcDNA的克隆： 利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSAcDNA，所用的引物为： PH1：5’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA； (3)HSAcDNA和CNPcDNA融合基因的克隆： HSAcDNA的PCR扩增，所用引物如下： P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P1：5’-AGCAGCTGGGAGAGATGCATGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAG-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次； CNPcDNA的PCR扩增，所用引物如下： P3：5’-CAAGTCAAGCTGCCTTAGGCATGCATCTCTCCCAGCTGCT-3’ P4：5’-AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCTCATGGAGCC-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-CNP1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性10分钟，56℃退火45秒，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次； 利用重叠PCR融合CNPcDNA和HSAcDNA： 将CNP的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物以体积比1∶1比例混合后作为模板，在50μl的PCR反应体系中加入：2.5mmol/L的dNTP4μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μlpfuDNA聚合酶1μl，混合好的模板2μl，双蒸水36μl；PCR条件为：95℃变性10min，65℃退火1min，72℃延伸4min30s，94℃变性1min，循环8次后，向反应体系中加入10μmol/L的P1和P4的引物各1μl，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片
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摘要
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人C-型利尿钠肽(CNP)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将HSA cDNA和CNP cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CNP cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主系统中进行表达。本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人C-型利尿钠肽至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的融合蛋白在保持了人C-型利尿钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。
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国际公布
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