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公开(公告)号
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CN101063125A
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公开(公告)日
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2007.10.31
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申请(专利)号
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CN200710020892.1
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申请日期
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2007.04.17
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专利名称
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人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品
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主分类号
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C12N15/09(2006.01)I
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分类号
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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江南大学
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发明(设计)人
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沈 微;金 坚;诸葛健;王 俊;张莲芬
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地址
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214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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无锡市大为专利商标事务所
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代理人
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时旭丹;刘品超
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国省代码
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江苏;32
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主权项
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人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是从新鲜人甲状旁腺组织中分离单核甲状旁腺细胞，刺激培养，提取RNA；通过RT-PCR反转录得到PTHcDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA；利用重叠PCR技术，连接HSAcDNA和PTHcDNA，中间不加入任何连接肽，得到的PTH-HAScDNA融合基因插入到克隆载体，PTH-HAScDNA融合基因在宿主系统中进行表达，PTH-HAScDNA融合基因被整合到宿主的染色体中； (1)PTHcDNA的克隆： 以RT-PCR反转录得到的PTHcDNA第一链为模板，通过PCR扩增出PTHcDNA，所用的引物如下： p1：5’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’ p2：5’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，PTHcDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环35次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.27kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经EcoRI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；随机挑取5个单菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有15％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-PTH，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-PTH； (2)HSAcDNA的克隆： 利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSAcDNA，所用的引物为： PH1：5’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HAS； (3)PTHcDNA和HSAcDNA融合基因的克隆： HSAcDNA的PCR扩增，所用引物如下： P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P2：5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次； PTHcDNA的PCR扩增，所用引物如下： P3：5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’ P4：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’ PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-PTH1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次； 利用重叠PCR融合PTHcDNA和HSAcDNA： 将PTH的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以4∶6体积比混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次； 通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用P
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摘要
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人甲状旁腺激素(PTH)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将HAS cDNA和PTH cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的PTH-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主系统中进行表达。本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人甲状旁腺激素至少85％序列同源的第二区。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的融合蛋白在保持了人甲状旁腺激素生理特性的基础上，延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。
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国际公布
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