| 公开(公告)号 | CN100349918C |
| 公开(公告)日 | 2007.11.21 |
| 申请(专利)号 | CN03134442.9 |
| 申请日期 | 2003.07.30 |
| 专利名称 | 呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白制备方法 |
| 主分类号 | C07K16/10(2006.01)I |
| 分类号 | C07K16/10(2006.01)I;C07K16/18(2006.01)I;G01N33/569(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 广东佰易药业有限公司 |
| 发明(设计)人 | 张国成;许东亮;余 军 |
| 地址 | 512026广东省韶关市芙蓉东路112号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 西安通大专利代理有限责任公司 |
| 代理人 | 李郑建 |
| 国省代码 | 广东;44 |
| 主权项 | 抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效价特异性免疫球蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)制备呼吸道合胞病毒腺病毒抗原 将呼吸道合胞病毒和腺病毒分别接种于已成长单层的Hep-2细胞或人胚肾细胞，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当致细胞病变出现+++以上时或经病毒抗原检测阳性，收集细胞及上清，病毒灭活后经超声打碎、冰冻保存； 或按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原； 按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原的方法是，用低温乙醇分离法或离子交换层析法方法或亲和层析法筛选的含高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的原料提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白，原料选自下组：人血浆、人血清、低温乙醇分离法的含特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的中间产物； 2)纯化病毒抗原 以蔗糖淀层浓缩或以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原，或层析吸附柱方法纯化病毒抗原； 所述的蔗糖淀层浓缩或以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原的方法是：将超声打碎的呼吸道合胞病毒和腺病毒抗原5000g离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％、60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，以165000g超速离心2小时，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存； 所述的层析吸附柱方法是：用离子交换层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，原料经DEAE-SepharoseCL-6B或DEAE-SepharoseFF柱，抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白流穿出柱；平衡条件为pH5.0～6.0，离子强度为0.01～0.03； 3)建立筛选高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白方法 用提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原10μg/ml～20μg/ml包被酶板，建立常规的ELISA方法或用病毒感染的细胞建立免疫荧光方法或用病毒抗原建立生物芯片方法，用以筛选正常人群献血源中高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白；并用中和试验方法确定高效价特异性免疫球蛋白的有效起始浓度，经血源性传染病原检测合格后，将血源冰冻保存，以备免疫球蛋白的制备； 所述的免疫荧光法是，用呼吸道合胞病毒和腺病毒接种Hep-2细胞，当细胞出现病变后，刮下细胞，以PH7.2，0.01MPBS缓冲液洗3次，制备抗原片，经冷丙酮固定后，冰冻保存，取待检血清或血浆，经稀释后，加于抗原片孵育，经洗涤后，加羊抗人荧光抗体，在荧光显微镜下观察，正常Hep-2细胞抗原片做阴性对照，判定结果； 所述的生物芯片方法是：用微孔滤膜为载体，固化入呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原，利用微孔滤膜的渗滤，浓缩，凝集作用，使待检的献血员血清或血浆与载体上的抗原进行快速反应，再与抗人IgG标记物直接在膜上反应显色，反应后的芯片放入芯片阅读系统，在专用的软件的支持下，对不同点阵的灰度值进行分析，从而实现对呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性IgG抗体的快速筛选； 4)筛选的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原用低温乙醇分离方法或离子交换层析法方法或亲和层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白； 所述的低温乙醇分离方法分离特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的乙醇浓度为15％～25％；pH为5.1～7.2；温度为-3℃～-7℃；离出含特异性抗病毒免疫球蛋白的沉淀或上清，经超滤浓缩脱醇，若提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原纯度低于97％，用离子交换层析法提高纯度，使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂，直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的抗病毒免疫球蛋白，其中条件为pH为5.0～6.8； 所述的离子交换树脂选自下组：DEAE-Sepharose、DEAE-SepharoseFF、S-Sepharose、S-SepharoseFF和DEAE-SepHadxA-50所述的离子交换层析法流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通过Lysine-Sepharose4B，将穿透液与洗涤液合并后，加入SP-SephadexC50或CM-SepharoseFF吸附，使用pH11的甘氨酸解析出特异性抗病毒免疫球蛋白；平衡条件为pH值6.0～5.4；解析条件为pH11的甘氨酸； 所述的亲和层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，对原料进行缓冲液处理后，通过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白穿过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白进行离子交换层析，从而获得纯化的特异性抗病毒免疫球蛋白； 亲和层析的固体载体选自：Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、SepharoseCL、SepharoseFF、Superdex、Superose、Trisaceyl、Trisacylplus、UltrogelA、UltrogelAcA、高孔隙度的再生纤维素珠；缓冲液的盐浓度为0.004～0.04，pH值为4.8～9.2； 5)提纯后的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白经60±1℃，10小时灭活病毒和/或在pH值4.1±0.3，在24±1℃条件下放置21天灭活病毒，再经除菌过滤，分装成抗病毒免疫球蛋白。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种有既可预防，又可治疗、标本兼治的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效价特异性免疫球蛋白的制备方法，首先用呼吸道合胞病毒或腺病毒经Hep-2细胞或人胚肾细胞培养增殖，制备病毒抗原，或根据呼吸道合胞病毒和腺病毒基因序列用基因工程方法表达制备的保护性抗原。其次经组织培养制备的病毒抗原，以不连续梯度密度离心纯化抗原，或以20％蔗糖淀层浓缩抗原，或层析吸附柱方法纯化抗原。然后用所制备的纯化抗原，建立筛选高效价抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的方法，及体外中和病毒试验等。最后用低温乙醇方法或离子交换层析法方法或亲和层析法在具有高效价呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白血源中提取免疫球蛋白。 |
| 国际公布 |
