公开(公告)号
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CN101130075A
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公开(公告)日
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2008.02.27
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申请(专利)号
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CN200710018543.6
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申请日期
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2007.07.23
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专利名称
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口蹄疫O、A、Asia-1型三价灭活疫苗
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主分类号
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A61K39/295(2006.01)I
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分类号
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A61K39/295(2006.01)I;A61K39/135(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I
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分案原申请号
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优先权
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申请(专利权)人
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中国农业科学院兰州兽医研究所
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发明(设计)人
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王永录;张永光;方玉珍;蒋守田;刘力宽;潘 丽;吕建亮
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地址
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730046甘肃省兰州市城关区徐家坪1号
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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甘肃省专利服务中心
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代理人
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鲜 林
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国省代码
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甘肃;62
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主权项
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一种口蹄疫O、A、Asia-1型三价灭活疫苗,由O型口蹄疫病毒抗原、A型口蹄疫病毒抗原、Asia-1型口蹄疫病毒抗原和佐剂按下述配比制成: 疫苗配制的比例为,抗原∶佐剂=1∶1; 其中抗原按下述重量百分含量配制: 45%的已灭活并经3倍浓缩的O型病毒抗原O/china/99、20%的A型病毒抗原AF/72和35%的Asia-1型病毒抗原Asia-1/XJ/KLAMY/04混合而成; 佐剂:采用蒙太得206佐剂——Montanide ISA 206佐剂; 上述原料按照下述工艺方法和顺序制备而成: a、毒种 a.1、O型毒种:牛源O型口蹄疫病毒O/china/99株细胞毒; a.2、A型毒种:牛源A型口蹄疫病毒AF/72株细胞毒; a.3、Asia-1型毒种:牛源Asia-1型口蹄疫病毒Asia-1/XJ/KLAMY/04株细胞毒; b、制苗材料的制备 制苗材料为BHK-21单层细胞,细胞的培养按一般组织培养方法进行; c、病毒的增殖 用15L转瓶BHK-21细胞通过浓缩培养法分别增殖制苗用O、A、Asia-1型病毒抗原,转瓶机转速为10~12r/h,收获病毒液,在-15℃下冻结保存; d、病毒灭活的程序,包括: d.1过滤;将冻结的0、A、Asia-1型制苗病毒液分别融化,经60~80目铜纱网过滤除细胞碎片,用7.5%NaHCO3调PH至7.6~7.8,并加200u/mL的青霉素、200μg/mL的链霉素; d.2灭活;向已过滤的O、A、Asia-1型病毒液中分别加入BEI二乙烯亚胺使其浓度达到2mmol/L,在37℃温室或发酵罐夹套水浴循环升温至30℃,并在30℃下持续灭活26h,其间每4h摇振1次,灭活终止期加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液,使其终含量为2%,置2~8℃冷库或发酵罐冰盐水保温待检; d.3安检;对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别进行安检,用每型灭活病毒液,颈背部皮下注射2~3日龄乳鼠,0.2mL/只,设对照乳鼠,观察7d,全部乳鼠不出现口蹄疫症状和发病死亡,方为灭活彻底; d.4菌检; 对O、A、Asia-1型灭活病毒液分别按《中国兽药典》进行无菌检验; e.浓缩将O型、A型、Asia-1型制苗病毒液分别物理浓缩3倍; f、疫苗配制 疫苗乳化,先将油佐剂相真空负压进料到乳化机内,搅拌过程中,将灭活的病毒液按比例真空负压进料到油佐剂相中,循环搅拌至抗原与佐剂充分混合后,通过均质机乳化成略带粘滞性的双相油乳剂疫苗; g、疫苗检验,包括: g.1、物理性状检查;该疫苗为矿物油乳剂型,外观呈白色或淡粉红色略带粘滞性流体。取一清洁吸管,吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面,呈云雾状扩散;吸取疫苗10mL,加入离心管中,以3000r/min离心15分钟,水相析出应不超过0.5mL;用1mL吸管(出口内径1.2mm)吸取25±1℃的疫苗1mL,令其垂直自然流出0.4mL,所需时间应小于或等于8s; g.2、无菌检验; g.3、安全检验 g.3.1用体重350~450g的豚鼠2只,每只皮下注射疫苗2mL;用体重18~22g的小鼠5只,每只皮下注射疫苗0.5mL,连续观察7日,均不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身反应; g.3.2用至少6月龄的健康易感牛3头,每头舌背面皮内注射20个点,每点0.1mL疫苗,逐日观察至少4d,之后,每头牛肌肉注射疫苗9mL,继续逐日观察6d,均不出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应; g.4、效力检验:用至少6月龄的健康易感牛45头,分为3组,每组15头。将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组,每一剂量组分别于颈部肌肉注射15头牛,接种21d后,将各剂量组免疫牛随机等分为O型、A型、Asia-1型三个攻毒组,连同对照牛各2头,分别进行攻毒;O型攻毒组,每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫O型病毒强毒,每点0.1mL,共0.2mL,含104ID50;A型攻毒组,每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫A型病毒强毒,每点0.1mL,共0.2mL,含104ID50;Asia-1型攻毒组,每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫Asia-1型病毒强毒,每点0.1mL,共0.2mL,含104ID50;连续观察10d;对照牛至少3蹄出现水泡或溃疡,免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡,而其它部位无病变时判为保护,除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫水泡或溃疡时判为不保护;根据免疫牛的保护数,按Karber法计算被检疫苗的PD50,每头份疫苗对0型、A型、Asia-1型口蹄疫的免疫效力应至少分别达到3PD50。
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摘要
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一种口蹄疫O、A、Asia-1型三价灭活疫苗,由O型口蹄疫病毒抗原、A型口蹄疫病毒抗原、Asia-1型口蹄疫病毒抗原和佐剂按抗原∶佐剂=1∶1比例,其中抗原配比:45%的已灭活并经3倍浓缩的O型病毒抗原O/china/99、20%的A型病毒抗原AF/72和35%的Asia-1型病毒抗原Asia-1/XJ/KLAMY/04混合而成;经:毒种、制苗材料的制备、病毒的增殖、病毒灭活的程序、菌检、浓缩、疫苗配制和疫苗检验步骤制备而成。本发明一次接种可同时预防O、A、Asia-1型三个血清型的口蹄疫,具有现用疫苗无法达到的便捷性和实用性,可降低用于防疫的人力、物力和财力,具有广阔的应用前景。
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国际公布
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