武汉大学微生物讲义

                       实验三 

[目的要求]

    通过对高氏Ⅰ号培养基的配制、掌握配制合成培养基的一般方法。

[实验原理]

    高氏Ⅰ号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。如果加入适量的抗菌药物(如各种抗生素、酚等)，则可用来分离各种放线菌。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。此外，合成培养基有的还要补加微量元素。

[教学内容]

    高氏Ⅰ号培养基的制备

实验四 

[目的要求]

通过对分离真菌的马丁氏(Martin)培养基配制、掌握选择培养基的配制方法，并确选择的原理。

[实验原理]

马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。这种培养基的特点是培养基中加入的孟加拉红和链霉素能有效的抑制细菌和放线功菌的生长，而对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。

[教学内容]

     马丁氏培养基的制备

实验五 

[目的要求]

1.了解干热灭菌的原理和应用范围。

2.学习干热灭菌的操作技术。

[实验原理]

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。

[教学内容]

干热灭菌

实验六

[目的要求]

1.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。

2.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

[实验原理]

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

[教学内容]

高压蒸汽灭菌

实验七 

[目的要求]

了解紫外线灭菌的原理和方法

[实验原理]

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成［O］，再使O2氧化生成自臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2均有杀菌作用。

[教学内容]

紫外线灭菌

实验八

[目的要求]

了解过滤除菌的原理；掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。

[实验原理]

过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。

[教学内容]

微孔滤膜过滤除菌

实验九 

[目的要求]

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

[实验原理]

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：1).简易单细胞挑取法; 2).平板分离法。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

[教学内容]

微生物的分离与纯化

实验十 

[目的要求]

1.了解不同的微生物在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征。

2.进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。

[实验原理]

微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。

检测微生物的培养特征时，接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要。

[教学内容]

微生物的培养特征

                          实验十一

[目的要求]

1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。

2.初步认识细菌的形态特征。

3.巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。

[实验原理]

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

[教学内容]

细菌的简单染色法

实验十二

[目的要求]

1.  学习并初步掌握革兰氏染色法。

2.  了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

[实验原理]

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

[教学内容]

革兰氏染色法

                         实验十三

[目的要求]

1.  学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。

2.  学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。

[实验原理]

鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项重要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02微米，所以，除了很少数能形成鞭毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。

[教学内容]

    鞭毛染色法及细菌运动性的观察

实验十四

[目的要求]

1．  学习并掌握观察放线菌形态的基本方法。

2．  初步了解放线菌的形态特征。

[实验原理]

放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。为了观察放线菌的形态特征，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验介绍其中几种常用方法。

[教学内容]

放线菌形态的观察

实验十五

[目的要求]

学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。增强微生物细胞大小的感性认识。

[实验原理]

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小

的测定在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。

[教学内容]

  微生物大小的测定

实验十五 

[目的要求]

1.  观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

2.  掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

[实验原理]

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

[教学内容]

酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

                         实验十六

[目的要求]

学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；了解四类常见霉菌的基本形态特征。

[实验原理]

霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为3～10微米)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。

[教学内容]

霉菌的形态观察

实验十七

  [目的要求]

1.明确血球计数板计数的原理

2.掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。

[实验原理]

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

[教学内容]

显微镜直接计数法

                      实验十八 

[目的要求]

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

[实验原理]

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony -forming units, cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

[教学内容]

平板菌落计数法

实验十九 

[目的要求]

1.了解光电比浊计数法的原理

2.学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

[实验原理]

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图Ⅷ-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度--菌数标准曲线。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。

[教学内容]

光电比浊计数法

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