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动物生化学重要技术(层析技术)

来源:本站原创 更新:2011-11-24 执业兽医考试论坛

一 基本原理
(一)原理
层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一,它是利用混合物中各组分的理化性质(吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)的差异,在物质经过两相(一个固定相,一个流动相)组成的体系中,不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程,可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分离。配合相应的化学、电学和电化学检测手段,可用于定性、定量和纯化某种物质。层析法的特点是分离率、灵敏度、选择性均很高的一种分离方法。尤其适合样品含量少,而杂质含量多的复杂生物样品的分析。固定相可以是固体也可以是被固体或凝胶所支持的液体;同样流动相可以是液体也可是气体。
(二)分类
按分离的原理可分为五类:
1、吸附层析: 固定相是固体吸附剂,利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。
2、分配层析: 固定相为液体,利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。
3、离子交换层析: 固定相为离子交换剂,利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。
4、凝胶层析: 固定相为多孔凝胶,利用各组分在凝胶上受阻滞程度不同而进行分离。
5、亲和层析:根据生物特异性吸附进行分离,固定相只能和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力者结合,而与无结合能力的其它组分分离。
按操作方式不同分为三类:
1、纸层析 以滤纸作为液体的载体,点样后,用流动相展开,以达到组分分离目的。
2、薄层层析 以一定颗粒度的不溶性物质,均匀涂铺在薄板上。点样后,用流动相展开,使组分达到分离。
3、柱层析 将固定相装柱后,使样品沿一个方向移动,以达到分离目的。

二 吸附层析
(一)原理
吸附作用是指某些物质(称吸附剂)能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象。吸附剂吸附能力的强弱除决定于吸附剂和被吸附物质本身的性质外,还和周围溶液的组成有密切关系。当改变吸附剂周围溶液的成分时,吸附剂的吸附能力即可发生变化,往往可使能吸附物质从吸附剂上解吸下来,这种解吸过程称为洗脱或展层。当样品中的物质被吸附剂吸附后,用适当的洗脱液冲洗,就能改变吸附剂的吸附能力,使被吸附的物质解吸下来,随着洗脱液向前移动,该物质又遇到前面新的吸附剂而再次被吸附,在后来的洗脱液的冲洗下又重新解吸下来,继续向前移动。经过这样反复的吸附—解吸附—再吸附—再解吸的过程,物质就可以不断向前移动。由于吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同,它们在洗脱剂的冲洗下移动的速度也就不同,因而能逐渐分离开来。
(二)吸附剂的选择
吸附剂的选择是否合适是吸附层析的关键。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素等。硅胶为微酸性吸附剂,适合分离酸性和中性物质;氧化铝是微碱性吸附剂,适合分离碱性和中性物质;硅藻土和纤维素为中性吸附剂,适合分离中性物质。www.lindalemus.com吸附剂的颗粒应有一定细度,并且粒度要均匀。一般颗粒直径为无机类0.07~0.1mm(150~200目);有机类0.1~0.2mm(70~140目)。颗粒太粗,层析时溶剂推进快,但分离效果差,而颗粒太细,展开太慢,易产生斑点不集中并有拖尾现象。
(三)吸附能力
一般用活度来表示吸附剂的吸附能力,吸附能力主要受吸附剂含水量的影响,其由强到弱的程度以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。吸附剂活度强时能吸附极性较小的基团;吸附剂活度弱时对非极性基团吸附能力也较强。一般利用加热烘干的方法,减少吸附剂的水份,从而增加其活度。通常,分离水溶性物质时,因其本身具有较强极性,故吸附剂活度要弱一些;相反,分离脂溶性物质时,吸附剂活度要强一些。
吸附层析根据吸附剂的装填方式可分为柱层析和薄层层析法两种。
(1)吸附柱层析法 选择一根适当尺寸的玻璃管,在管的底部垫以尼龙网、玻璃棉或烧结玻璃板等,再填装一定量的吸附剂,然后在顶部加入样品溶液,待样品全部流入吸附剂内后,再加入洗脱液进行洗脱,不同组分即以不同的速度向下流动而逐渐分离开来。最后从下端出口处流出,分步收集洗脱液,即可得到各组分的溶液,供进一步处理和测定。
(2)吸附薄层层析法 薄层层析法是把吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层。把要分析的样品加在薄层的一端,在密闭的容器中,用适当的溶剂展层后达到分离、鉴定的目的。
薄层层析的优点是:设备简单、操作容易、层析时间短、分离效率高,是发展较快的一种微量,快速的层析方法,可用于氨基酸、核苷酸、糖类、脂类和激素等物质的分离和鉴定。
薄层层析的操作方法包括制薄板、点样、展层、显色等过程,薄层经显色确定斑点位置后,计算Rf值。然后与文献记载的Rf值比较以鉴定各种物质。


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