三 分配层析
(一)原理
在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流动相，此过程称分配过程。分配层析是利用混合物中各组分在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离目的的层析技术。分配系数是指在一定的温度，压力和一定的溶剂系统中，一种物质分配达到平衡时在两个互不相溶的溶剂中的浓度比值，常用Ｋ来表示：
Ｋ＝溶质在固定相的浓度（Cs)/溶质在流动相的浓度（Cm)
不同的层析机理，其Ｋ值函义不同。吸附层析中，Ｋ值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数；离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和常数。Ｋ值大表示溶质在固定相中浓度大，洗脱时溶质出现较晚。Ｋ值小表示溶质在流动相中浓度大，在洗脱时出现较早。
分配层析中常用滤纸为支持物称之为纸上分配层析。纸层析以滤纸为惰性支持物。滤纸纤维与水有较强的亲和力，约能吸收２０～２２％的水，其中部分水与纤维素羟基以氢键形式存在，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂)。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行溶液分配，由于混合物中各组分在相同条件下具有不同的分配系数，因而随流动相移动的快慢就有差异，于是就能将这些组分分离开来，形成距原点不等的层析点，溶质在纸上的移动速度可用迁移率Ｒｆ值表示：
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
Rf值是物质定性的基础，一般分配系数大的组分，因移动速度慢，所以Rf值较小；而分配系数较小的组分，则Rf值较大。可以根据测出的Rf值来判断层析分离的各种物质，当与标准在同一条件下测得的Rf值进行对照时，即可确定该层析物质。
(二)操作要点
纸析法的操作分为点样、展层、显色、测定等。展层方式有单向（上行法、下行法)，双向和经向（环形)之分。为了提高分辨率，纸层析可用两种不同的展开剂进行双向展层。双向纸层析是把滤纸载成长方形或方形，一角点样，先用一种溶剂系统展开，吹干后，转90度，再用第二种溶剂系统进行第二次展开。这样，单向纸层析难以分离清楚的物质，通过双向纸层析往往可以获得比较理想的分离效果。
纸层析法既可定性又可定量。定量方法一般采用剪洗法和直接比色法两种。剪洗法是将组分在滤纸上显色后，剪下斑点，用适当溶剂洗脱后，用分光光度法定量测定。直接比色法是用层析扫描仪直接在滤纸上测定斑点大小和颜色深度，绘出曲线并可自动积分，计算结果。
四 离子交换层析
(一)原理
离子交换就是指液相中的离子与固相上的活性基团离子的可逆交换反应。
www.lindalemus.com利用这个反应将要分离的混合物先在一定pH值的溶液中全部解离，而后流过固定相使之与固相上的离子进行交换，吸附于固相上，再根据混合物中解离度的差别，用不同pH值的溶液
分别洗脱下来，达到分离混合物中组分的目的。
离子交换层析技术除大量应用于分离生物化学代谢物质的工业生产外，还广泛应用于生物化学和分子生物学的理论研究。近年来，该技术与其它技术相结合，制成了固相肽自动合成装置、氨基酸自动分析仪，核苷酸自动分析仪、气相色谱仪、蛋白质合成仪等。离子交换层析技术已经成为生化领域各个方面的基本技术之一。
(二)离子交换剂的类型
离子交换层析中固相称为交换剂。它是一种高分子不溶物质。目前常用的有人工合成的树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。在这些不溶性母体上引入不同的活性基团，即具有离子交换作用，成为各种类型的离子交换剂。引入母体上的活性基团主要分酸性和碱性两类，酸性基团能解离出H+可与溶液中阳离子交换。所以这类离子交换剂称为阳离子交换剂；碱性基团因能解离出OH-与溶液中的阴离子交换，所以这类离子交换剂称为阴离子交换剂。由于引入的酸性和碱性基团的强弱不同，这两类离子交换剂又分为强酸型和弱酸型以及强碱型和弱碱型。如：酸性树脂中含磺酸基（－SO3H)的称强酸型；含磷酸基（－PO3H2)、亚磷酸基（－PO3H)的称中强酸型；含有羧基（－COOH)、羟基（－OH)的称弱酸型。碱性树脂中含季胺［－N+(CH3)3］的称强碱型，含叔胺［－N(CH3)2］、仲胺（NHCH3)、伯胺（－NH2)基的称弱碱型。
离子交换剂的作用原理如下：
阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子交换：
R-SO3-H+＋M+---→R-SO3M＋H+
阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换：
R4-N+OH-+W----→R4-N+ W-＋OH-
OH-＋H+---→H2O
（Ｍ＋代表溶液中阳离子，Ｗ－代表溶液中阴离子)
由于不同生物大分子的电荷密度分布不同，电荷量不等，等电点的差异及分子大小的区别，因而与离子交换剂的结合强弱也不同，当它们被结合到固定相交换基团上以后，主要依靠增加缓冲溶液的离子强度或改变酸碱度来进行洗脱。当缓冲液离子强度增加时，即增加了它与生物大分子对交换基团竞争吸附的能力，把生物大分子置换下来，改变酸碱度，使缓冲溶液的ｐＨ接近生物大分子的等电点，其净电荷为零，从而可被洗脱。
(三)离子交换层析基本操作
１、交换剂的选择 交换剂的选择必须考虑到被分离物质及交换剂的性质，如被分离的物质是阳离子就应选用阳离子交换剂，反之则选用阴离子交换剂。溶液中的离子在交换剂中交换吸附不仅受自身电荷数的影响，也受到它与离子交换剂的非极性亲和力及交换剂空间结构大小等因素影响。因此在分离某物质时，必须根据物质的解离性能、分子大小，选择适当类型的离子交换剂。再如像分离蛋白质，核酸时，为了不改变其生物活性，要选用条件温和的交换剂，如纤维素交换剂，而不能选用交换条件强烈的交换剂，如磺酸型树脂等。
２、交换剂的处理、转型与再生 离子交换剂在使用前必须进行处理，即将离子交换剂先用蒸馏水浸透使之充分吸水膨胀，并用无离子水洗至澄清，以去除漂浮物及杂质等。然后用酸和碱分别处理，以除去某些不溶物。如离子交换树脂的处理方法是：先用４倍量的2mol/LHCl浸泡4h以上，除去酸液，用无离子水洗至中性，再加４倍量2mol/LNaOH浸泡4h以上，除去碱液，再用无离子水洗至中性备用。离子交换纤维素则用0.5mol/L的NaOH和0.5mol/LHCl处理。离子交换葡聚糖凝胶一般不用酸碱处理，使用前需在中性溶液中完全膨胀（室温1～2天，沸水浴2h)。处理过程中不需去除细小颗粒。避免强烈的搅拌，清洗时，最好用布氏漏斗除滤液，代替倾注法以减少损失。
用过的交换剂，经处理后还可继续使用，处理过程称为“再生”。一般是用酸和碱分别浸泡，再用水洗至中性。但离子交换树脂不一定要用酸和碱处理，即只要“转型”就可以了。所谓转型就是使用时希望树脂带上何种离子。如希望阳树脂带Na+，则用NaOH处理；如希望树脂带Ｈ+则用HCl处理；希望它带NH4+，则用NH4OH或NH4Cl处理。阴树脂转型也是同样道理，若希望带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。总之，树脂处理,再生和转型的结果是希望带上我们需要的离子，因此最后的处理即是转型处理，不论转为何型，前后都要用无离子水洗至中性（若最后一步用碱处理，水洗至流出液pH＜８；用酸处理的，水洗的流出液pH＞６即可)。
３、装柱 离子交换层析多用柱层析法。
www.lindalemus.com首先应将柱放垂直，在柱内装入1/3的溶液，然后将处理好的交换剂用溶液稀释，一边搅拌一边加入柱内，使交换剂均匀沉降，至交换柱高1cm左右，打开下口，使溶液慢慢流出，同时不断地加入搅匀的交换剂，直达到要求的柱高为止。装好的柱要求没有明显的分界线，不能有气泡，柱床面要平坦。装好的柱床面上要保持一层溶液，以防空气进入。
４、样品上柱 柱装完毕后，用所需的缓冲液平衡，上样时应把柱面上的溶液放出，至液面与柱床面相同高度，用滴管加入样品，打开下口，使样品进入柱床，当样品液与柱床面相平时，用少量缓冲液洗管壁，这样使样品全部进入柱内，以防止出现拖尾现象。
５、洗脱 一般是根据所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团，从而把吸附物质顶替出来，利用此原则选择各种洗脱液。洗脱液是由不同离子强度和不同pH的缓冲液组成，用以分离样品的不同组分。改变洗脱方式主要有分步洗脱（或分段洗脱)和连续梯度洗脱法。
（１)分步洗脱法 预先配制不同离子强度的缓冲溶液，分段换用离子强度由低到高，pH相同或不同的洗脱液以洗脱生物大分子的各种组分。
（２)梯度洗脱法 早期采用两个直径相同底部相通的大型容器，将离子强度低的缓冲溶液放入一容器（混合瓶)中，其下端装有一个搅拌器，并连接到色谱柱的顶端，另一个容器存放离子强度较高的缓冲溶液。在洗脱过程中，因缓冲液由贮存瓶不断流入经搅拌器的混合瓶中，使流入色谱柱的洗脱液离子强度呈梯度增加，而pH亦逐渐变化。这样可分管自动收集，使结构相近的生物大分子较易分离。近期，人们已设计出了可以自动梯度洗脱的分离洗脱，具有非常好的重现性。
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