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常 用 配 体 |
分 离 对 象 |
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酶 |
底物、抑制剂、辅酶 |
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抗体 |
抗原、病毒细胞 |
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核酸 |
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白 |
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激素 |
受体、载体蛋白 |
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细胞 |
细胞表面特异蛋白 |
亲和层析中，一对互相识别的分子互称对方为配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认为是激素的配体。
亲和层析是将配体固定在固相载体上，并且将其装入层析柱中，当样品通过层析柱时，由于配体和相对应的生物大分子有专一性的亲和作用，将某种生物大分子吸附在柱中，样品中的其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。
亲和层析法具有高度的专一性，而且层析过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。
(二)操作方法
亲和层析的分离方法随分离的物质不同而不同，一般的程序如下：
选择配体→选择偶联的凝胶→偶联配体→装柱→平衡→上样→洗涤未结合的杂质→洗脱目标物质→样品。
１、配体的选择 能与分离物质牢固、特异和可逆结合的物质都可以作为配体。选择配体有两个条件：
第一，生物大分子与配体间具有合适的亲和力，亲和力太强，洗脱条件剧烈，易造成生物大分子失活，亲和力太小，解离容易，结合率不高；
第二，是配体要具有双重功能，既有可牢固与载体结合的基团，结合后又不影响生物大分子与配体间的亲和力。
２、载体的选择及与配体的偶联
对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。
实践证明，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是亲和色谱的优良载体。琼脂糖凝胶结构开放，通过性好，酸碱处理时相当稳定，物理性能也好。琼脂糖凝胶上的羟基在碱性条件下极易被溴化氰活化成亚氨基碳酸盐，并能在温和的条件下与氨基等基团作用而引入配体。亲和色谱中最为常用的琼脂糖凝胶的型号是Sepharose-4B。在琼脂糖与溴化氰活化后，再与生物大分子结合形成亲和色谱填料是亲和色谱中最为常用的一种。
３、装柱、上样 亲和色谱吸附剂制备好后，装入色谱柱中，色谱柱无特殊要求，常用短而粗的柱子。根据纯化物质的量、吸附能力来选择。吸附能力高的常用短柱，吸附能力弱的常用长一些的柱子。
样品为固体时，常用起始缓冲溶液溶解，若为液体，要通过透析等方法将溶液转换为起始缓冲溶液。上样量可根据柱子的吸附容量来推算，通常为吸附容量的1/3或更低，对于吸附力弱的物质，上样量按照1/10为佳。在样品上柱后，使用10倍柱体积的缓冲溶液将不结合的杂质清洗掉获得最尖锐的洗脱峰和最小洗脱体积的流速为最佳流速。
４、洗脱 从柱中洗脱目标产物是亲和色谱是否成功的关键。www.lindalemus.com通常采用降低目标产物与配体之间的亲和力的方式进行洗脱。可用一步法或连续改变洗脱剂浓度的方式将目标产品洗脱下来。当蛋白质与配体间的作用力过强时，可用一步法，甚至可先让洗脱剂在柱子中停留半小时的方法。
改变pH同样也能改变配体与蛋白质间的作用力，因此通过改变pH也是亲和色谱分离目标产物的一种方法。另一种方法是通过改变离子强度来洗脱目标产品，有时也用变性剂来洗脱目标产品。因此，亲和色谱分离目标产品的方法并不是一成不变的，可根据样品的性质和自己的条件进行选择。
对于吸附得十分牢固的生物大分子，必须使用较强的酸或碱作为洗脱剂，或在洗脱液中加入破坏蛋白质的试剂，如脲、盐酸胍。这种洗脱方式往往造成不可逆的变化，使纯化的对象失去生物学活性。因此，对于洗脱得到的蛋白质溶液应立即进行中和、稀释或透析。
