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聚合酶链式反应(PCR)技术

来源:本站原创 更新:2012-6-5 执业兽医考试论坛

聚合酶链式反应(PCR)技术

1  试剂

1.1  消化液

1.1.1  1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)

三羟甲基氨基甲烷                              12.11g

灭菌双蒸水                                      80mL

浓盐酸                                   调pH至8.0

灭菌双蒸水                                加至100mL

1.1.2  0.5M 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)

二水乙二铵四乙酸二钠                          18.61g

灭菌双蒸水                                      80mL

氢氧化钠                                 调pH至8.0

灭菌双蒸水                                 加至100mL

1.1.3  20% 十二烷基磺酸钠(SDS)溶液 (pH7.2)www.lindalemus.com

十二烷基磺酸钠                                   20g

灭菌双蒸水                                      80mL

浓盐酸                                   调pH至7.2

灭菌双蒸水                                 加至100mL

1.1.4  消化液配制

1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)        2mL

0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)           0.4mL

20% 十二烷基磺酸钠溶液(pH7.2)                    5mL

5M 氯化钠                                        4mL

灭菌双蒸水                                加至200mL

1.2  蛋白酶K溶液

蛋白酶K                                         5g

灭菌双蒸水                                加至250mL

1.3  酚/氯仿/异戊醇混合液

碱性酚                                         25mL

氯仿                                           24mL

异戊醇                                          1mL

1.4  2.5mmol/LdNTP

dATP(100mmol/L)                                20µL

dTTP(100mmol/L)                                20µLwww.lindalemus.com

dGTP(100mmol/L)                                20µL

dCTP(100mmol/L)                                20µL

灭菌双蒸水                               加至800µL

1.5  8pmol/µL PCR引物

上游引物ATXU(2 OD)加入701µl灭菌双蒸水溶解,下游引物ATXD(2 OD)加入697µL灭菌双蒸水溶解,分别取ATXU、ATXD溶液各300µL,混匀即为8pmol/µL 扩增引物。

1.6  0.5单位Taq DNA聚合酶

5单位Taq DNA聚合酶                            1µL

灭菌双蒸水                                加至10µL

现用现配。

1.7  10×PCR缓冲液

1.7.1  1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0)

三羟基甲基氨基甲烷                            15.8g

灭菌双蒸水                                     80mL

浓盐酸                                  调pH至9.0

灭菌双蒸水                               加至100mL

1.7.2  10倍PCR缓冲液

1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL

氯化钾                                       0.373g

曲拉通X-100                                   0.1mLwww.lindalemus.com

灭菌双蒸水                                加至100mL

1.8  溴化乙锭(EB)溶液

溴化乙锭                                       0.2g

灭菌双蒸水                                 加至20mL

1.9  电泳缓冲液(50倍)

1.9.1  0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)

二水乙二铵四乙酸二钠                         18.61g

灭菌双蒸水                                     80mL

氢氧化钠                                调pH至8.0

灭菌双蒸水                               加至100mL

1.9.2  TAE电泳缓冲液(50倍)

三羟基甲基氨基甲烷(Tris)                      242g

冰乙酸                                      57.1mlL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)          100mL

灭菌双蒸水                             加至1 000mL

用时用灭菌双蒸水稀释使用

1.10  1.5%琼脂糖凝胶

琼脂糖                                          3g

TAE电泳缓冲液(50倍)                            4mL

灭菌双蒸水                                    196mL

微波炉中完全融化,加溴化乙锭(EB)溶液20µL。

1.11  上样缓冲液www.lindalemus.com

溴酚蓝0.2g,加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50ml水溶解后,移入已溶解的溴酚蓝溶液中,摇匀定容至100mL。

1.12  其它试剂

异丙醇(分析纯)

70%乙醇

15mmoL/L氯化镁

灭菌双蒸水


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