关于雏鸭
病毒性肝炎诊断问题
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鸭病毒性肝炎（duckvireshepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒（duckhepatitisvires，DHV)引起的雏鸭急性败血性、高度致死性传染病，其特征是患鸭呈现沉郁、转圈、
抽搐、角弓反张等神经症状，并具有肝脏肿胀、出血，胆囊充盈，胆汁颜色变淡等病理变化。鸭肝炎呈世界分布，其病原具有三个抗原性互不相关的血清型（血清Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型)。我国自1958年在上海发现本病至1996年前后，各地暴发与流行的鸭肝炎病原均属于标准DHV-I型，其疫情可以被标准DHV-I型疫苗及抗体良好控制。1996年福建林世棠报道在福州地区发现不能被标准DHV-I型疫苗保护的鸭肝炎，1997年3月广东珠江三角洲及其附近地区大面积暴发典型DVH，在使用传统标准DHV-I型弱毒疫苗及其蛋黄抗体防制时，控制结果出现多样性。部分疫情可以用标准DHV-I型高免蛋黄抗体控制，免疫保护率达95%以上;部分疫情用标准DHV-I型高免蛋黄抗体控制不力，往往需要重复注射抗体1～2次，免疫保护率在75%左右;部分疫情用标准DHV-I型高免蛋黄抗体控制的效果很差，发病死亡率在80%～90%，但使用本地分离强毒制备的高免蛋黄抗体或高免血清则可控制。珠江三角洲及其附近地区正在大面积流行DHV-I型鸭肝炎，其部分毒株的毒力有所增强，其抗原性发生了变异，使得所流行的DVH发病日龄、发病死亡率均有增大倾向，采用DHV-I标准毒株的弱毒疫苗或相应高免蛋黄抗体的防制效果出现多样化，甚至常发生免疫失败。因此，建立有效准确的诊断方法和防制对策对本病的预防有重大意义。 1 诊断 1.1 临床诊断 本病主要感染3周龄以内的雏鸭，3～10日龄的雏鸭为高易感群体。潜伏期很短，为1～4天，雏鸭突然发病，开始时病鸭表现精神萎靡，不能随群走动，眼睛半闭，
嗜睡。出现这些症状1～3h后表现神经症状，运动失调，身体倒向一侧，双腿作痉挛性运动，呈角弓反张姿态，俗称"背脖病"。通常在出现神经症状后，十几分钟即死亡。有些发病急的病雏鸭往往突然倒毙，常看不到任何症状。 1.2 病理变化 本病的主要病理变化是在肝脏。肝肿大，质脆，色暗或发黄，肝表面有大小不等的出血斑点。多数病鸭的肾脏发生出血和肿胀，胆囊肿胀。组织学变化的特征是肝细胞变性和坏死，部分肝细胞脂肪变性。 1.3 病毒分离 Ⅰ型鸭肝炎病毒分离可无菌采取雏鸭肝脏制成悬液，加氯仿，离心取上清液，经尿囊腔接种8～10日龄鸡胚或10～14日龄鸭胚，观察胚体的病变和死亡情况，收集尿囊液。用病料或收获的尿囊液经肌肉接种易感雏鸭，经24～48h死亡，若具有DVH的典型特征和症状，并且也能从死亡雏鸭中分离到病毒，即可证实此病。也可用直接荧光抗体技术在自然病例或接种鸭胚的肝脏上进行快速、准确的诊断。 Ⅱ型鸭肝炎病毒分离较困难，需要在鸡胚尿囊腔内连续传代。敏感雏鸭对Ⅱ型DVH攻击的反应是多种多样的。Ⅱ型鸭肝炎病毒最可靠的诊断方法是用电镜观察肝匀浆，检出星状病毒。 Ⅲ型鸭肝炎的检测方法是对10日龄的鸭胚经绒毛尿囊膜接种病料，观察接种部位和胚胎的病变。 1.4 血清学方法 血清学方法包括用鸡胚、鸭胚、雏鸭以及用细胞培养的病毒进行中和实验、被动血凝实验、间接血凝实验、胶体金免疫电镜技术、SPA协同凝集试验，以及酶联免疫吸附实验等。 1.4.1 血凝实验 孙泉云等粗提DHV经Sephadex6200柱层析纯化后作为致敏用抗原，
戊二醛法固定
绵羊红细胞、BDB法致敏抗原红细胞，建立了检测DHV抗体的间接血凝试脸，其最佳致敏条件为：50%醛化红细胞0.1ml，BDB2ml，DHV抗原0.5mg，37℃15min。本试验还对不同
鸭血清的IHA抗体及免疫雏鸭的抗体水平等进行了检测，经与中和试验比较，阳性结果符合率较高。 1.4.2 中和实验 秦智锋等将鸭病毒性肝炎病毒（ATCC株)用鸡胚传一代后，测出此病毒的鸡胚半数致死量（ELD50)，通过多次重复试验，建立了利用鸡胚中和试验和雏鸭中和试验检测鸭病毒性肝炎（DVH)的诊断方法。雏鸭中和试验是在本体动物上进行试验，灵敏度高，判断准确。特别是鸭体本身的症状与病变对于确证该病非常有说服力。且与鸡胚中和试验相比，其所需周期短，操作相对简单。但由于个体之间的差异，各个体之间相对抵抗力不同，所以重复性较差。鸡胚中和试验操作简便，其死亡的胚体病变也具有特征性。但有些分离到的病毒不能初次就在鸡胚上增殖，需
盲传2～3代后方有特征性的病变。此外，鸡胚试验所需时限长，不能适应快速诊断的要求。 1.4.3 琼脂免疫扩散 许伟琦等选择接毒后48～72h死亡的含毒量最高峰时期的鸡胚体作为抗原材料，通过反复研磨冻融和超声波裂解使抗原成分充分暴露，并用氯仿抽提除去类脂质和杂蛋白，以PEG透析和硫酸铵沉淀法来浓缩和纯化病毒，克服了非特异性反应，并在琼脂糖板内加入2% PEG，大大加快沉淀反应，24h即能做结果判定，而且提高了沉淀线清晰度。 1.4.4 胶体金标记 程安春等用经过初步提纯的DHV制备的高免血清经过非特异性吸收，同时对观察用的病毒样品及抗血清用前经13000r/min处理，去掉一些杂质，使制备的免疫胶体金样品在电镜视野下基本看不到杂质，非常清晰，用胶体金免疫电镜技术和直接电镜（DEM)、免疫电镜（IEM)比较观察了鸭肝炎病毒，观察到待检病毒，免疫胶体金比DEM、IEM法清晰。视野中附着金颗粒的病毒量多，很容易就观察到，而不像DEM和IEM那样，由于背景杂质多，景像不清，病毒量少，镜下寻找较困难。胶体金免疫电镜技术是在免疫电镜基础上，加进在电镜下具有强烈反差的金颗粒，故大大提高了检测效果。胶体金免疫电镜技术可用于检测鸭病毒性肝炎病毒，具有简便、快速、灵敏、直观等特点，可作为快速检测鸭病毒性肝炎病毒的常规方法。 张小飞等用胶体金标记提纯后的
兔抗鸭肝炎病毒（DHV)IgG，建立了一种以微孔滤膜为固相载体，以红色胶体金为标记物的检测DHV的斑点免疫金渗滤法（DIC-FA)，并确定了最佳试验条件。该法既可定性，亦可定量，其敏感性为抗原斑点试验（AST)的2倍。特异性阻断试验和交叉反应试验证明DIGFA检测DHV具有较高的特异性。对DHV鸡胚尿囊液DIGFA法检出率为100%。DIGFA法是一种微量、敏感、特异、快速、简便的检测DHV方法。 1.4.5 SPA协同凝集试验 SPA是大多数金色
葡萄球菌细胞壁上所含的一种主要成分。SPA能天然地和人类IgG分子Fc段结合的特点，克服了ELISA中酶标抗体或酶标抗体特异性的局限。酶标SPADotBlotlmmunoassay简化了DHV的抗原、抗体的免疫检测方法，对筛选DHV病毒的敏感细胞株和单克隆抗体的特异性检测等，在特异性、重复性及定性、定量等诸多方面，都获得了较满意的效果。 1.4.6 ELISA诊断法 其优点是灵敏度高，操作简便，特异性强。 ELISA双抗夹心法 陈溥言等建立了ELISA双抗夹心法以检测病毒，将其研制的单抗应用于病毒的检测，能够灵敏地检测病毒样品。 单抗捕捉法ELISA 孙泉云等将单抗的高度特异性与ELISA的高度灵敏性结合起来，建立了用以检测DHV抗体的单抗捕捉法ELISA方法。该法能有效区分阴、阳性血清，非特异性背景很小。同时对抗原的纯度要求也很低，甚至是尿囊液也能克服非特异性反应。 酶标Dot-ELISA 杨奎等采用过碘酸钠法将
辣根过氧化物酶标记在纯化的DHV上，建立了酶标Dot-ELISA法用于检测DHV抗体。与以Polyvinyl板或Polystyrene为固相载体的ELISA法相比，酶标Dot-ELISA方法抗原用量少，很适于DHV这类难以提纯的病毒的抗体的检测。马秀丽等采用过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记纯化的Ⅰ型鸭肝炎病毒单克隆抗体建立了检测Ⅰ型鸭病毒性肝炎的Dot-ELISA方法。该方法简便易行，特异性好，与鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、鸡传染性囊病病毒、鸡新城疫病毒等无交叉反应，重复性高，对病毒尿囊液的最低检出范围为1∶16，而对肝脏病料的最低检出范围为1∶160。该方法可用于临床发病鸭的检测。 间接ELISA 杨萍萍等制备了鸡抗DHV高免血清，并成功地用葡聚糖凝胶柱层析纯化抗原包被酶标板，建立了检测鸡抗DHV血清抗体的间接ELISA方法，经交叉试验和阻断试验表明，该方法具有很高的敏感性和特异性，应用于DHV抗体检测比较有效。 由于鸭肝炎病毒有多种血清型并且病毒难以分离和纯化，至今没见其他关于DVH的分子生物学诊断方法的报道。 2 防制措施 目前还没有有效的化学药物对雏鸭病毒性肝炎进行治疗，因此该病重在免疫预防。 2.1 主动免疫 2.1.1 弱毒疫苗 程安春等将DHV通过鸡胚连续传代致弱而获得疫苗株，对种鸭和雏鸭进行免疫。种鸭在收集种蛋前2～4周注射疫苗，雏鸭于3周内可获得母源抗体保护，一般免疫期为6个月，5～6个月后应考虑第二次免疫;雏鸭在1日龄免疫弱毒疫苗，3～7天可产生免疫力，但母源抗体可影响效果，对有母源抗体的1日龄雏鸭采用口服免疫的效果优于注射免疫。但由于某些地区出现Ⅰ型变异株疫情，用标准DHVI型弱毒疫苗或其抗体控制的效果呈现明显的多样性，部分基本可以控制，部分控制效果很差。这就是目前部分地区采用标准鸭肝炎Ⅰ型（DHV I型)的弱毒疫苗免疫效果不好的原因。 2.1.2 灭活疫苗 国内外有鸡胚和鸭胚组织灭活苗，并证明鸭胚灭活苗比鸡胚灭活苗效果好。但如果没有弱毒苗的基础免疫，只使用灭活苗的抗体效价很低。由于母源抗体的存在会影响免疫效果，因此没有母源抗体的雏鸭才可以进行免疫。对存在母源抗体或情况不明的雏鸭可肌肉注射高免血清或蛋黄抗体进行预防。免疫效果除了受母源抗体的影响外，还受暴露于强毒的时间和严重程度的影响。如果雏鸭在出壳后早期暴露于强毒，特别是雏鸭病毒性肝炎呈地方性流行及严重感染的地区，其免疫效果也会降低。采用适当的卫生措施有助于解决这一问题。 2.1.3 二联和多联疫苗 陶淑珍等针对雏鸭的二种主要传染病鸭浆膜炎、鸭病毒性肝炎制备的二联灭活疫苗，免疫2周龄雏鸭;2周后攻毒鸭浆膜炎保护力达6/8上，鸭病毒性肝炎保护力达7/8以上;雏鸭免疫持续期可达12周以上，种鸭免疫后DHV抗体保护持续期1个月以上，并对疫苗的保存期进行试验证明二联灭活疫苗效果理想。 鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒二联疫苗 张大丙等将雏鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的鸡胚弱毒分别免疫1日龄易感雏鸭，经攻毒试验和中和试验，雏鸭5日龄时能分别抵抗各自强毒攻击，说明这两株弱毒在同一鸭体内都能迅速产生免疫力，互不干扰。抗鸭肝炎病毒的抗体消长规律、抗鸭瘟病毒强毒攻击的保护情况分别与各自单苗一致。攻毒试验还表明，二联疫苗针对DPV的免疫期在2个月以上，也未受到DHV弱毒的影响，从抗体监测结果看，二联疫苗免疫雏鸭抗DHV中和抗体消长曲线与单苗情况也一致，因而针对DHV的免疫期也未受到DPV弱毒"的干扰。野外实验亦表明，DHV、DPV两株弱毒同时免疫也可以获得分别免疫单苗的效果。结果表明，分属于两个病毒科的DHV、DPV弱毒进入同一鸭体互不干扰对方的增殖并至少在2个月内互不干扰对方的免疫力的产生和维持。 程安春等对鸭瘟一鸭病毒性肝炎二联疫苗的配比、稳定性、保护条件、保存期、攻毒试验、免疫后抗体消长规律及二联疫苗的田间试验、免疫途径等进行了比较全面的研究，也证明了二联苗免疫成鸭的效果与各自单苗基本一致。 2.2 被动免疫 采用出壳鸭苗于24～28h内注射鸭病毒性肝炎蛋黄液，配合人用乙肝
中草药剂效果尤佳，可获100%保护。康复鸭血清和高免血清中都含有能中和病毒的抗体，可用于治疗病鸭或用于被动免疫，效果良好。 用鸡接种鸭DVH病毒油剂灭活疫苗，强化免疫，能获得相应特异性蛋黄抗体，防治鸭DVH病具有良好的效果，也能避免应用同源蛋黄液可能带来的疫病传播。 据国外研究报道，不同血清型病毒在血清学上有着明显的差异，无交叉免疫性。因此，雏鸭发病后，即使使用高免血清或高免蛋黄也不一定产生良好的效果，如果是同一血清型效果肯定好。而注射高免血清或蛋黄次数及注射后能产生多大保护率尚没有确切的数据，临床使用时可根据病情而定。 另外，四川农业大学禽病防治研究中心已研制出抗鸭病毒性肝炎二价（Ⅰ＋Ⅲ型)高免抗体，1日龄雏鸭皮下注射1m1即可有效预防Ⅰ型和Ⅲ型雏鸭病毒性肝炎，治疗剂量2～3ml/只，具有良好效果。对种鸭可在开产前15～30天进行1～2次免疫，可保护下一代雏鸭不患Ⅰ型和Ⅲ型雏鸭病毒性肝炎。 2.3 中草药 中草药的作用在于，调理机体的气血，疏肝理脾，调整机体的代谢功能和免疫功能。顺克巧等用
茵陈、
龙胆草、
黄芩、
黄柏、
栀子、
柴胡、
板蓝根、双花、
防风等疏肝理气、调整气血、清热解毒等中草药，治疗鸭病毒性肝炎。整个试验观察5天，死亡率为5.37%，比抗体对照组、空白对照组的死亡率分别低6%和近57%。祝建新等用自配的"鸭肝散"制剂（茵陈、龙
胆草、黄芩、黄柏、
金银花、板蓝根、栀子、柴胡、防风、
钩藤、
神曲、
荆芥、
甘草等13味中药经炮制按比例混合后煎熬两次，煎液合并浓缩至含生药0.5g/m1)治疗鸭病毒性肝炎，其效果与高免蛋黄抗体相当，而且不易复发。
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