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火鸡出血性肠炎(Hemorrhagic Enteritis HE)自Pomeroy和Fenstermacher最先在美国报道以来，已有60多年的历史，但至今仍是遍及世界火鸡养殖地区的一种急性传染病。该病是由火鸡出血性肠炎病毒引起的，它主要感染四周龄或较老龄的火鸡，以火鸡沉郁，脾肿大，出血性肠炎，免疫抑制等为典型特征，可经口腔或泄殖腔感染，但没有经卵传染本病的报道。自然感染的死亡率随火鸡年龄和饲养管理条件而不同，由10％到60％，实验感染的死亡率可高达80％，给经济养禽业带来严重的损失，据估计美国各州每年因本病造成的损失竟达3百万美元以上，已引起人们极大的关注。国外对该病的研究比较多，且随着分子生物学的迅速发展，该病毒在病毒分子学领域的研究也已取得了较大的进展。国内对该病的研究和报道还很少见。本文就国外对HEV的生物学特性、基因组结构、病毒编码蛋
白及其功能等方面研究作一综述。1 火鸡出血性肠炎病毒生物学特征 火鸡出血性肠炎病毒(Hemorrhagi Enteritis Virus，HEV)是引起火鸡出血性肠炎的病原体。它连同
雉鸡大
理石纹脾病病毒(MSOV)，鸡大脾病病毒(ASSV)同属腺病毒科，禽腺病毒属1群中的成员。在血清学方面它们与禽腺病毒I和Ⅲ群成员有严格的区别。病毒粒子呈二十面体对称，无囊膜，为裸露的线形双股DNA。直径约为72nm。SureshM等用DNA杂交技术和PCP,扩增技术研究表明HEV的复制主要集中在脾脏中的B淋巴细胞和巨噬细胞，产生大量的IgM，而不能在CD4+和CD8+T淋巴细胞中繁殖，这点HEV与哺乳动物腺病毒完全不同(哺乳动物腺病毒能感染T淋巴细胞并在其中繁殖)。据RautenschleinS报道其繁殖的速度与宿主脾脏细胞凋亡的速度呈正相关。HEV在感染的细胞浆中相当稳定，对乙醚、氯仿有抵抗力，但在丙酮中不稳定，对酸碱度及温度的耐受范围较宽。2 HEV的基因组结构 HEV的基因组全长为26 263bp，是目前已知腺病毒中最短的一个。其G+C含量为34。93％。在其基因结构中起始密码为
甲硫氨酸，编码容量大于100个
氨基酸的开放阅读框架(ORF)有八个，编码50～100个氨基酸的ORF，上链有16个，下链有21个。 HEV的末端倒置重复序列(ITR)有39个碱基对，这与其它腺病毒相比要短许多。在人腺病毒9～18位碱基对之间有TTAT保守序列，是病毒复制的起始点。HEV在该区域与人腺病毒具有高度的保守性，只是缺失了第12位上的腺嘌呤。末端前体蛋白(PTP)和DNA聚合酶(POL)复合物在此处与之相连。第19位一39位之间为B区，含GGGAGG序列，SPl转录因子可能与该序列相互连接并促进病毒DNA复制的快速有效启动。 腺病毒基因组由早期转录单位和晚期转录单位组成。早期转录单位(E1～E4)与病毒DNA复制、代谢和调节有关。其中El、E4是病毒生长必需区，对病毒复制、转化和关闭宿主蛋白合成起重要作用。HEV的E1区和E4区与其它的腺病毒很不相同，它由二簇开放阅读框架构成。对应El区的有ORFl、2、3、4．对应E4区的有ORF7、8。鸡胚致死孤儿病毒(CELO)的El区与HEV的n区很相似。从CELO能够诱导小仓鼠形成
肿瘤可以知道，CELO的ORF中分布着El区的一些编码基因，在这一方面HEV很可能与之相似。与其它腺病毒相同，HEV的E2基因产物直接涉及病毒DNA复制和转录调节。其中，E2A区主要编码DNA结合蛋白(DBP)，E2B区编码末端前体蛋白(PTP)和DNA多聚酶(POL)。HEV的E3区是一个900bp的开放阅读框架。与其它的腺病毒相同，该区位于HEV的PVI和纤维蛋白之间。在此区中不同的腺病毒编码各种大小不同的蛋白产物。由于该区是腺病毒生长非必需区，缺失或取代E3区的腺病毒在细胞上仍能生长，因而人们常在该区插入外源基因构建重组腺病毒。 HEV的晚期转录单位(L1-L5)与其它腺病毒相同，主要编码病毒结构蛋白和部分晚期调节蛋白，是装配成成熟病毒粒子所必需的。HEV的RNA转录物主要起始于晚期启动子(MLP)，根据剪切方式及终止位点的不同，分成5组，分别为：L1(52k，Ⅲa)、L2(五邻体，CPl，CP2)、L3 (PVI，六邻体，内肽酶)、L4(100k，33k，P)、L5(纤维蛋白)。 在腺病毒感染期间，也有病毒蛋白的合成，它们主要是PVI和N2中期基因，HEV与其它禽腺病毒一样无PVI基因，Ⅳ2基因比其它腺病毒要短，能促进主要晚期启动子的表达。3 病毒蛋白的结构与功能3．1 E1区编码蛋白 HEV无明显的Ela、Eib区，HEV在该区的编码蛋白可能就分布在ORFs中。这些蛋白与细胞凋亡有关。3．2 病毒晚期结构蛋白 对HEV晚期结构蛋白的研究尚未完全弄清，该文就其中较为清楚的晚期蛋白做一叙述。3．2．1 五邻体 土2个五邻体颗粒分别位于病毒20面体的顶上。五邻体由基部和由基部向外伸出的纤丝组成。HEV每个五邻体有一条纤维突起，这与EDSV不同，EDSV每个五邻体有二条纤维。在许多的人腺病毒中，有一个共同的三肽序列，即Arg／Gly／Asp(RGD)，该序列是病毒与宿主细胞连接整合的位点，并引起细胞对病毒的内吞作用。HEV的五邻体基座上无RGD序列，因而，HEV可能不是通过与宿主细胞上的。V整合进宿主的。进一步的序列分析揭示五邻体基座上的Leu-Asp-Va[(LDV)氨基酸序列与人腺病毒是一致的。纤维蛋白上的LDV基元通常与宿主淋巴细胞和巨噬细胞上的04p1相互连接整合。HEV五邻体基座上的LDV序列预示了其可能就是通过该序列与Q4p1整合进宿主细胞。3．2．2 核心蛋白 JuckerMT等用DNA杂交技术对HEV基因作图谱分析发现HEV的核心蛋白分别对应于人腺病毒的Pv蛋白、mu蛋白和PVII蛋白，位于六邻体和PVI之间。核心蛋白1具有丰富的Arg／Pro／tMa．这可能与它在DNA的装配中充当DNA结合蛋白有关。3．2．3 PVI HEV的PVI大小与其它的腺病毒的基本相同。在蛋白的两个末端具有相同的两个切割位点。在PVI N端约30位的I型内肽酶切点(L，M，I)XGG'X和位于其C端的II型内肽酶切点高度保守，后者的切割将产生长为11肽的巯基内肽酶辅助因子。PVI-11肽中的半
胱氨酸对二聚体的形成和巯基内肽酶的激活是必需的。3．2．4 六邻体 HEV的六邻体蛋白大小约100kDa。由于它是构成病毒衣壳的主要蛋白，它的大小对病毒的大小起着决定性的作用。六邻体与其它的蛋白相连，它的氨基酸序列在决定腺病毒不同型与群表面特异性抗原方面起着非常重要的作用。基于这点，早在1993年，vandenHurk JV等人就用HEV六邻体制备的单克隆抗体免疫火鸡，结果得到很好的保护。同时，他们也发现，用非天然的六邻体蛋白来免疫火鸡并不能产生相应抗体，从而可以看出六邻体的天然构象对其免疫的重要性。继后，CardonaCJ等(2001，1999)[n-12-]将HEV六邻体基因及构成它的100kDa折叠蛋白基因与鸡痘病毒进行整合并表达，并用其表达的产物来免疫火鸡，结果发现其体内含有高滴度的病毒抗体。用此法制备的重组疫苗不仅能够产生很好的免疫力，且无常规疫苗接种后所产生的免疫抑制现象。3．2．5 病毒蛋白酶 与其它腺病毒相比，HEV蛋白酶的C末端比其它的腺病毒多了几个氨基酸。不同的腺病毒，其蛋白酶氨基酸序列在一些区域具有保守性。在人腺病毒的蛋白酶中有三个氨基酸构成酶的活性中心，即His54，Glu71，Cysl22．HEV的活性中心与之相似，只是Asp取代了Glu71。在活性中心以外的区域也高度保守，这可能在稳定活性中心是必需的。该酶是所有腺病毒中最保守的蛋白，它主要切割病毒蛋白的(M，L，1)XGXG和(M，L，1)XGGX位点，对病毒粒子的成熟和感染力至关重要。3．2．6 纤维蛋白 HEV的五邻体基座上只有一个纤维蛋白，其长度比其它的腺病毒要短，约有17nm。从其N端至C端依次排列着蛋白纤维三个典型的结构域，即尾区，柄区，顶端球区。它的作用主要是识别细胞上的特异受体，从而使病毒与宿主细胞特异的结合。3．3 E2区蛋白 E2区主要包括以下几种蛋白。3．3．1 末端前体蛋白(pTP) I-lEV的pTP有597个氨基酸，由严形成成熟蛋白须在蛋白的第169和297位点进行切割，该切割位点与鸡减蛋综合征病毒(EDSV)接近，为第156和265氨基酸。该蛋白的功能主要是在病毒复制起始中充当引物并促进病毒编码的DNA多聚酶的核定位。3． 3．2 DNA多聚酶(POL) HEV的POL无论在大小和氨基酸序列方面都与其它腺病毒相似。LPutcovshc：]对其蛋白进行分析发现，其925-933氨基酸残基序列与DNA多聚酶B家族相同。3．4 DNA结合蛋白(DBP) HEV 的DBP位于负链内在蛋白与100kb基因之间，大小约345个氨基酸残基，比其它的腺病毒要小。它的C末端与其它的腺病毒具有高度的同一性。它与病毒DNA结合并启动晚期启动子进行复制。此外，在核的定位及转录和转录后水平调控中也发挥着重要的作用。3．5 lVaII 是病毒中期表达蛋白，它对病毒晚期基因的表达起着重要的调节作用。3．6 E3区和E4区 HEV的E3区编码的蛋白产物与OAV的E3区编码产物具有低相似性。E3区与E4区分别编码具有调控作用和与宿主细胞成分紧密相连的蛋白质，由于腺病毒具有对宿主的选择性，因而在这些区域所编码的蛋白也具有选择性，但作用可能都相似，如E3区基因产物主要与抵抗宿主免疫作用有关，E4区编码产物主要是促进病毒的复制，增强病毒晚期基因的表达，并抑制宿主基因的表达。然而到目前为止，人们还不太清楚其准确定位。4 HEV与其它腺病毒的关系 腺病毒的分类中有三个参数对其分类地位起着关键性的作用，它们分别是反向末端重复系列(1TR)，G+C百分含量和病毒DNA的长度。我们已知HEV含有26 263bp，是目前所知道最短的腺病毒。G-PC百分含量为34．93％，比其它禽腺病毒低。EDSV的G+C百分含量为42．5％，CELO为54，3％，人腺病毒百分含量在48％～59之间，羊腺病毒(OAV)的Gq-C百分含量与之接近为33．6％。HEV的ITR含39bp，在人腺病毒中相同的亚属ITR的大小相似。通过与其它腺病毒相比发现，如果按以往腺病毒分类情况来看，HEV无论从结构基因的大小，ITR长度还是Gq-C百分含量都与哺乳动物腺病毒OAV非常的相近，OAV的长度为29 544bp，G+C百分含量为33．6％，ITR有46bp。而与禽腺病毒却相隔较远。另外，从它们的基因组结构与序列来分析比较也发现，HEV与OAV腺病毒的关系比较近，这样的矛盾引发我们不得不去想，哺乳动物腺病毒与禽腺病毒的分类是否要作重新的修改。5 HEV分子病毒学研究的意义与前景 近年来，随着对腺病毒研究的不断深入，尤其在动物腺病毒方面，由于其具有与人腺病毒类似的基因组结构，能转染人的细胞，具备将外源基因转移到人细胞内的能力，却不能在人细胞内复制，有较高的安全性，已引起人们高度的重视。HEV作为禽腺病毒中的一员，从分子病毒学角度对其基因组进行分析，从而使人们更加清楚其致病机理，且为寻找保护性抗原制作活载体疫苗提供理论依据，以弥补现有疫苗免疫后出现的抑制现象。又由于HEV除能感染其天然宿主火鸡外，还能感染雏鸡，因而，它也可以作为鸡的活载体，在鸡体内表达鸡病毒保护性抗原为构建鸡疫苗提供新的思路。总之，这所有的一切都有待于人们对HEV基因组的进一步了解，以获得更大片段的非必需区供外源基因插入，为多价基因工程活载体疫苗的构建奠定基础，同时HEV基因组的结构与功能的探索，又为基因治疗提供清晰的分子生物学背景。相信在不久的将来，HEV分子病毒学研究必将会有新的突破和广泛应用。
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