针对猪圆环病毒的检测技术研究
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猪圆环病毒 病是由猪圆环病毒(PCV)感染引起的，以免疫抑制为特征的一类病毒性 传染病 ，临床表现主要是由PCV-2引起的 仔猪 断奶后多系统衰竭综合征。文章就近几年国内外对该病毒检测技术，包括病毒分离、电镜观察、聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、免疫组织化学技术、酶联免疫吸附试验、原位核酸杂交试验等的研究进展做了阐述。 猪圆环病毒病是近年来倍受关注的一种在世界各地广泛存在的慢性疾病，是一系列疾病的总称。自1974年Tischer I等 首次发现猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)以来，随着对PCV研究的深入，根据猪圆环病毒的致病性及其基因组差异又可将其分为无致病性的猪圆环病毒1型(PCV-1)和有致病性的猪圆环病毒2型(PCV-2)。PCV-1对猪无致病性，但能产生血清抗体，在猪群中普遍存在，接种2日龄与9日龄的猪无临床症状。PCV-2对猪有致病性，主要导致一种以断奶仔猪呼吸急促或困难、
腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变和进行性消瘦为特征的新的疾病，即断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，造成了很大的经济损失。由于猪群中普遍存在着PCV抗体，单一的抗体阳性不能确诊为阳性，确诊必须依靠实验室方法检测出PCV-2抗原或核酸。由于病毒复制困难，所以检测和防控研究非常困难。同时，该病易与一些病毒性和细菌性疾病混合或继发感染，因此仅凭症状、病变及
流行病学调查很难做出准确判断。为此，各国兽医工作者进行了大量的研究，建立了多种高度特异性的病毒学、免疫学和分子生物学诊断方法。文章就目前国内外PCV的检测技术研究进展进行综述。 1病毒分离 猪圆环病毒的分离培养多数是从病猪中采取肺、肝、脾、淋巴结和扁
桃体等组织，制成组织匀浆，用氯仿处理除去有囊膜的病毒，接种PK-15细胞，利用氨基
葡萄糖短时间处理感染细胞，以促进病毒的增殖。吕艳丽等 从北京、河北分离了3株PCV-2，并对其中的2株进行了测序，序列分析比较发现，它们与欧美分离毒株具有很高的同源性。郎洪武等 用Dulac
猪肾传代细胞分离到了2株圆环病毒。崔尚金等从我国的22个省市分离到了32株猪圆环病毒，并对其中6株进行了测序，呈送到GenBank。另外，还有很多研究人员从各地分离到多株猪圆环病毒。 2电镜观察 电镜下可以观察到一种较小病毒，是猪圆环病毒特有的直径约为17 nm的球型结构，以及大量不同形态的胞浆内包涵体。 3聚合酶链式反应检测 聚合酶链式反应(PCR)做为一种快速、简便、特异的诊断方法，目前为病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术，其优点为敏感、特异、快速、准确。在PCV 的检测方面应用广泛，且发展了很多改良的技术。 3.1多重PCR 检测 Huang C I等 建立了一种简单的多重PCR法，可对PCV 进行检测和定型。该方法设计了两套引物，是根据PCV核酸链上的ORF1和ORF2设计的。Calsamiglia M等 建立了一种多重PCR法，可对PCV进行检测和定型。作者根据PCV-1和加拿大PMWS猪中分离的PCV-2的ORF1和ORF2序列设计两套引物，这两套引物都可以对PCV进行检测和定型。郎洪武等 根据PCV种的特异性和PCV-2型的特异性，设计两对PCR引物，进行多重PCR检测PCV。一对引物扩增出的片段具有PCV种的特异性，扩增区域是相对保守的ORF1部分核苷酸片段，大小约为900 bp。另一对引物扩增出的片段具有PCV-2型的特异性，扩增区域呈可变性相对较大的ORF2部分的核苷酸片段，大小约为470 bp。Kim J等 在2003年建立了石蜡包埋组织中同时检测PCV-1、PCV-2和PPV多重套式PCR法，检测了人工感染病例和自然感染病例，结果与原位杂交方法完全一致。 3.2定量竞争性PCR检测 定量PCR是根据PCR的产物量来推断其原始模板量。Liu Q等 建立了竞争性PCR方法检测血清中的PCV 的DNA。选取PCV-1和PCV-2的ORF2中变异性高的区段设计两对型特异性引物，并引入一个外源片段的重组质粒，以此作为竞争性模板，用上述两对引物扩增出的PCV-1或PCV-2片段能够与野毒株的扩增片段相区别。当倍比稀释的已知浓度的质粒DNA和待测DNA共同的PCR产物的电泳条带亮度相同时，便可以推算出待测DNA的浓度。崔尚金等 运用此方法在试验过程中采用内标竞争模板，竞争模板和目标模板共用一个反应体系，不仅降低了非内标性模板不同PCR反应管间的差异，而且在对样本进行质控监测，排除了假阴性结果。 3.3复合PCR检测 复合PCR是一种特殊的PCR技术，即在同一反应体系中加入多对引物，扩增多个基因片段，此法方便快捷，已广泛用于医学临床诊断。芦银华等 应用复合PCR，在同体系中用3条引物扩增PCV两种血清型的DNA片段，从而达到PCR扩增一次就可检测鉴别PCV-1和PCV-2的目的。试验从PK-15细胞中扩增出了PCV-1和PCV-2特异的基因片段，表明复合PCR方法的建立，为PCV的检测、分型及临床PMWS的诊断提供了有效的工具。朱军莉等 1 采用复合PCR，对浙江、上海等地的猪场，具有明显的“高热综合征”临床表现猪的淋巴结进行检测，发现PCV-2的阳性率为39.40%，而PCV-1的阳性率为33.33%。
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