猪流感病毒H1N1分离株HA基因的克隆与序列分析
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猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病。流感病毒属于正黏病毒科，包括A、B、C、托高土病毒属4个属。A型流感病毒可以感染多种动物，包括许多禽类和哺乳动物。B型和C型病毒似乎只能从人体内分离到，虽然也从猪体内分离到了C型流感病毒，但感染猪的主要还是A型流感病毒。早在1918年，美国、匈牙利和中国就有关于猪流感的报道，这与1918年西班牙人类大流感的时间一致。目前该病呈世界分布，但主要以地方性流行为主。单纯的SIV感染表现为发病率高(100%)。病死率低(约5%)的特点，其严重程度与流行毒株、猪的日龄和健康状况、环境条件及细菌性继发感染相关。猪流感不仅危害猪体健康，同时影响育肥猪的上市时间，并增加饲养成本，对养猪业造成的损失不容忽视。猪流感病毒不仅对猪体健康和养猪业危害大，在整个流感病毒的遗传进化和生态分布中都占有重要地位，特别是对人类健康具有潜在的威胁。虽然近年来发生了多起禽流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例，但一般认为流感病毒具有种属特异性，即禽流感病毒很难突破种间屏障直接感染人。2006年底，无锡某猪场发生不同程度的呼吸系统疾病，本研究对从该猪场分离的一株具有血凝特性的毒株H1N1，利用RT-PCR扩增HA基因。经遗传分析表明，该分离株属古典型H1N1，极可能在人-畜-禽间相互传播。1 材料与方法1.1 材料新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒H9N2、猪流感病毒H3N2、人源流感病毒PR8株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠。A/Swine/Wuxi/1/07(H1N1)病毒株分离于江苏无锡地区某发病猪场鼻拭子样品；SPF鸡胚(9日龄)购自山东SPF鸡胚孵化场。1.2 载体与主要试剂pGEM-T easy载体、T4 DNA连接酶、RT-PCR试剂盒购于美国Promega公司；凝胶回收DNA试剂盒购于德国QIAGEN公司；EcoRⅠ酶购自MBI公司。1.3 HA基因的扩增1.3.1 病毒RNA提取 通过SPF鸡胚扩增上述病毒，收集尿囊液，经浓缩后采用Trizol试剂提取各病毒RNA。吸取250 μL病毒液至1.5 mL用DEPC水处理过的Eppendorf管中，加入750 μL Trizol试剂，混匀后置15 ℃～30 ℃作用5min；加入0.2 mL的氯仿，用手剧烈摇15 s，室温静置5 min；于4 ℃ 以12 000 r/min离心15 min；取上清于另一个Eppendorf管中，加入500 μL的异丙醇，室温作用10 min，于4 ℃以12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入750 mL/L的
乙醇1 mL漂洗2次；干燥后用DEPC水重悬，－20 ℃保存备用。1.3.2 分离株亚型鉴定 分别采用Choi等建立的鉴别H1和H3亚型的RT-PCR法对分离株进行亚型鉴定。鉴别H1和H3亚型的两套引物序列为：HF1：5′-GGGACATGTTACCCAGGAGAT-3′，HR1：5′-GCATTGTATGTCC AAATATCCA -3′，HF3：5′-TATGCCTGGTTTTCGCTCAA-3′，HR3；5′-TTCGGGATTACAGTTTGT TG-3′。第一套引物扩增片段长度为1 006 bp，为H1亚型特异性；第二套引物扩增片段长度为663 bp，为H3亚型特异性。PCR反应参数为：94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s,30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.3.3 HA的引物设计 根据已发表的
猪流感H1N1 HA序列设计上游引物P1：ATG AAA GCA AAA CTC CTG ATC CTG T；下游引物P2：CAG ATG CAT ATT CTA CAC TGC AAA，以尿囊液提取的RNA为模板扩增HA基因。1.3.4 HA全基因片段的RT-PCR 按Promega公司的AMV RT-PCR试剂盒操作说明书进行，反应体积为25 μL。反应混合物包括RNA模板5 μL，上下游引物各0.1 μmol/L，AMV逆转录酶2.5 U，Taq DNA聚合酶2.5 U，RNA酶抑制剂20 U，dNTP混合物1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L。进行反应时，首先逆转录反应50 ℃ 30 min，然后94 ℃ 2 min，使逆转录酶失活，再进行常规PCR。1.4 重组质粒的构建及鉴定PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分别利用QIAGEN公司凝胶回收试剂盒回收，与pGEM-T easy载体按1∶8(摩尔比)于4 ℃连接12 h，转化DH5α，用AIX(含有0.1 mg/mL Amp， 0.1 mg/mL IPTG，0.02 mL X-gal)LB平板蓝白斑筛选，提取白斑的质粒DNA，用Eco RⅠ酶切鉴定，筛选阳性克隆。1.5 序列分析通过DNA Star软件和BlastN软件分析HA基因的遗传特性，分析该分离株的遗传背景和来源。
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做好管理和消毒
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消毒做好
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