猪传染性胃肠炎及流行性
腹泻比较研究
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猪传染性胃肠炎及流行性腹泻比较研究 要害词：猪传染性胃肠炎；猪流行性腹泻；比较研究猪传染性胃肠炎(porcinetransmissiblegastroenteritis，TGE)和猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhoea，PED)分别是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以猪
呕吐、腹泻、
脱水为特征的传染病。TGE猪传染性胃肠炎对新生 仔猪 具有高度致死率，虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周龄以上猪的死亡率则很低。1945年，Doyle在美国首次报道发生了本病。我国1956年在广东省首次报道，给养猪业带来严重危害。猪流行性腹泻是一 种猪 肠道传染病，哺乳 仔猪 受害最严重。本病主要发生在冬季，夏季也可发生。20世纪70年代初首先发现于英国和比利时，我国从20世纪80年代初开始陆续有本病的流行。1973年先后在我国上海、辽宁、吉林、黑龙江、四川等地分离到TGE和PED病毒。目前，已成为重要的猪病毒性腹泻病之一。多年来，包括我国在内的许多国家为了预防和控制TGE和PED，曾投入了一定的人力、物力和财力，但迄今为止这两种疾病仍在世界上许多国家存在，且PED可与TGE混合感染，二者在
流行病学、临床症状、剖检变化上非常相似，给临床诊断带来一定困难。近年来随着分子生物学技术的发展，TGE与PED的研究取得了较大进展。本文就TGE和PED近年来的研究进行比较综述如下。1．病原特征猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒皆属于套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属(国际病毒分类委员会第7次分类报告，2000年)。朱维正等发现PED与TGE在血清学上的不一致，马思夺采用聚乙二醇沉淀法结合蔗糖梯度密度离心法纯化PED，以改良的SDS—PAGE分析表明，PED粒子有六种结构蛋白，其分子量分别为P133KD、P240KD、P353KD、P462KD、P5163KD和P6190KD，除P5(纤突蛋白)与TGE在电泳条中带排布有显著差异外，其余5种结构蛋白则与TGE很相似。上海农科院畜牧所报道，用荧光抗体技术发现PED和TGE在小肠粘膜绒毛上皮细胞内的感染存在着动态差异，TGE首先感染小肠绒毛基部的上皮细胞，以后再向绒毛的顶部发展，而PED在早期首先感染绒毛上部，以后逐步向绒毛基部发展。2．流行病学2．1TGE流行病学2．1．1流行特点:呈季节性发生，12月至次年4月发病最多，夏季发病少。在新疫区主要呈暴发性流行，在老疫区则呈地方性流行。2．1．2临床症状:潜伏期很短，约15～18h，有的可延长至2～3d，传播快，几天内可波及全群。典型症状是出现短暂的呕吐，伴有或继发水样腹泻，粪便黄色、绿色或白色，因脱水体重迅速下降。病理剖检：病变主要在胃和肠道，以小肠病变为主，表现为肠壁变薄透明，肠内容物稀薄如水，呈黄色，偶然可见胃底出血。２．．2PED流行病学2．1．1流行特点:本病在12月至次年3～4月间多发，夏季也有猪感染发病，但相对较少。哺乳 仔猪 、断奶 仔猪 和育肥猪感染发病率可高达100，成年母猪发病率较低，为15～19。哺乳 仔猪 受害最严重，病死率平均50。本病通常在有一头猪发病后，同圈或毗邻猪相继于一周内发病，经过2～3周后流行终止.2．1．2临床症状:潜伏期，新生 仔猪 为24～36h，育肥猪为2d以上。病猪表现呕吐、腹泻、脱水，开始时粪便黏稠，后变成水样便;精神沉郁，厌食，消瘦并衰竭。1周龄以内的哺乳 仔猪 常于腹泻后2～4d内死亡。断奶猪、育肥猪症状轻，发病4～7d后逐渐恢复正常。病理剖检：剖检可见肠壁变薄，肠内有黄色粘稠液体，小肠粘膜绒毛大部分萎缩变短，上皮细胞坏死脱落。全身淋巴结肿大、出血，肾小管上皮细胞变性坏死。3．诊断目前，对这两种传染病的诊断方法主要有病毒中和试验，免疫荧光法，免疫电镜法，ELISA法RT-PCR法。随着分子生物学的不断发展，ELISA法和RT-PCR法以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。3．1TGE诊断方法3．1．1病毒的分离与鉴定原代和次代
猪肾细胞、猪肾传代细胞系、猪唾液腺原代细胞、猪甲状腺原代细胞以及McClurkinST传代细胞已成功地用来从被感染猪的粪便及肠道内容物中分离TGEV。在ST或猪甲状腺细胞上的典型CPE由具有膨胀的、圆形或长形外观如气球的细胞组成。ST传代细胞已用于蚀斑或IF实验以检测TGEV野毒株，Kemeny(1978)。为提高病毒的分离率，在细胞培养液中加
胰酶制剂或胰蛋白酶和使用较老的细胞可进一步提高ST细胞的敏感性，Bohl(1979)。Pocock和Garwes(1975)报道，在次代猪甲状腺细胞用弱酸性营养液时TGEV增殖滴度最高。3．1．2电镜法检测通过电镜负染色法证实，在感染
猪肠内容物和粪便中有TGEV。发病期间病毒存在于病猪的许多器官中，实验证实除脾脏外，其他器官均可检测到病毒，但是以空肠、十二指肠和肠系膜淋巴结中含毒量最高。通过电镜观察，病毒多分布在胞浆的空泡里和微绒毛间隙。在微绒毛间的病毒往往呈串球状排列。研究证实，免疫电镜(IEM)比常规EM技术更好，前者对检测临床样品或细胞培养物中的TGEV更敏感，并可提供病毒血清学鉴定。此外，用IEM更易区分TGEV和常见的膜类碎片，而且同时可检测其它肠道病毒的存在。经IEM观察，TGEV与PEDV之间未见到免疫交叉反应。3．1．3免疫荧光法检测免疫荧光法(IF)和免疫过氧化物酶技术都可应用，但前者较常用。若IF或免疫过氧化物酶试验呈阳性，并伴有腹泻症状，则几乎肯定为TGEV。国外在小肠上皮细胞中检测TGE病毒抗原，采集病死猪小肠或腹泻早期将猪捕杀，取空肠和回肠粘膜涂片或将空肠和回肠制备冷冻切片进行直接或间接免疫荧光检测的方法已经建立，并得到广泛应用。但本方法必须在死后或扑杀后才能进行。我国哈尔滨兽医研究所研制成功了扁
桃体采样器，采取猪只的扁桃体组织，做成冷冻切片，进行直接免疫荧光法检测TGE病毒抗原。本法是活体诊断，可以迅速做出判定，已广泛应用于疫病普查和口岸检疫。另外，一种用抗TGEV高糖蛋白N的单克隆抗体免疫过氧化物酶技术来检测TGEV(小肠组织)的方法已建立，且TGEV的单克隆抗体已被用IF或免疫过氧化物酶试验中。用上述两种实验方法已在呼吸道组织和鼻腔上皮细胞中检测出TGEV。用抗TGEV单克隆或多克隆抗体双层夹心ELISA方法已被广泛应用于检测在细胞培养、粪便和肠内容物中的TGEV，是一种快速且适用于从活猪中取得大量样品的诊断方法。3．1．4血清学诊断TGEV抗体可通过数种不同的血清学方法检测，如间接荧光抗体试验、间接免疫过氧化物酶试验、放射免疫沉淀试验、病毒中和试验(VN)等，最常用的是VN试验。近年来研究发现，TGEV与猪呼吸道冠状病毒(PRCV)有一定相关性，血清中和试验(SN)特异性不强，可能出现假阳性。但在大批量检测或对群体进行监测时，可先用SN试验进行筛选，对阳性样品再用如阻断酶联免疫吸附试验(B-ELISA)等特异性很强的试验进行鉴定，使TGE抗体检测更为准确、快速。张净等用阻断ELISA和SN法对来自美国和中国的196份
猪血清检测TGEV抗体，结果表明上述两种方法的检测结果存在显著差异。这些TGEV-SN阳性的血清(121头份)在用阻断ELISA检测PRCV抗体时有57头呈现阳性反应，这与Callebaut等(1989)的试验结果相一致，说明用SN法检测TGEV抗体时出现假阳性是由于PRCV与TGEV之间能呈完全中和交叉反应所致。周仲芳等 报道了用杆状病毒表达系统生产的TGE病毒纤突蛋白(S蛋白)建立了一种竞争ELISA检测猪TGE血清抗体，获得了较为理想的特异性和准确性。之后又报道了采用同样的重组抗原建立了一种间接ELISA用于TGE血清抗体的检测，同时由于在结果判定中采用终点滴定技术，使得检测结果的判定更直观和迅速。3．1．5分子生物学诊断近年来，已发展了用核酸杂交探针技术如放射性探针膜杂交、放射性标记探针原位杂交来检测粪便样品，感染组织或感染细胞中的TGEV基因序列。用这些探针可区别不同的肠TGEV毒株。RT-PCR和非放射性标记物cDNA探针也已被用来区分TGEV和PRCV分离物。1997年，Woods和Paton等应用RT-PCR技术检测TGEV，结果证实RT-PCR是一种特异、敏感的TGEV诊断方法。李军等 建立了检测TGEV的RT-PCR方法。用此RT-PCR方法检测56份猪腹泻粪样，同时用夹心ELISA法作对照。结果显示，RT-PCR法检测的20份阳性粪样，用夹心ELISA法检测有14份呈阳性，两者的符合率为89。试验结果表明，RT-PCR法可检出1pg的TGEVRNA，比夹心ELISA法敏感性更高。最近KimL和ChangKO针对TGEV与PRCV二者S基因部分序列的差异性发展了一种将巢式PCR与RT-PCR相结合的方法即RT-巢式PCR法。3．2PED诊断方法3．2．1免疫电镜法IEM法既可用已知的PEDV高免血清检测未知抗原，又可用已知的PEDV抗原检测未知抗体。王继科等把抗原和抗体分别经10000g离心、免疫复合物又经12000g离心、最后在电镜下直接观察到典型的病毒粒子形成的免疫复合物，建立了具有3次筛选作用的改良的IEM法，具有简便、直观、快速和定性正确等优点。3．2．2免疫荧光法用直接免疫荧光法(FAT)检测PEDV是可靠的特异性诊断方法，目前应用最为广泛。崔现兰等应用FAT检查病猪小肠的冷冻切片或小肠抹片，对PEDV人工感染 仔猪 的检出率为91.4，电镜观察阳性率为47.8。应用间接免疫荧光法(IFAT)对PED阳性猪血清的检出阳性率为89。林志雄等用适应于Vero、PK15等传代细胞株生长繁殖的PEDV-G1株建立直接免疫荧光法。该方法并不和猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反应。3．2．3微量血清中和试验林志雄等建立了PED微量中和试验，采用适应于传代细胞生长的PEDVG1株，以PK15作指示细胞，48h判定。研究证实本方法检验准确、可靠，具有较高的敏感性，可用于流行病学调查。3．2．4ELISA法ELISA法最大的优点是可从粪便中直接检查PEDV抗原，目前应用也较为广泛。陈茹等用分离纯化的PEDV抗原，建立斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测猪流行性腹泻(PED)抗体。采用此方法分别对来自加拿大、台湾省进口的 种猪 和海南省、广东省 种猪 群的血清样共834份进行了检测，检测的抗体阳性率达21。用琼扩试验与Dot-ELISA比较，阴性血清样品检测符合率为100，而阳性血清样品检测符合率为31.8，说明后者更敏感，且该试验重复性较好。于强等用PEDV吉株猪胎肠单层细胞培养物，以冻融法制备抗原，建立了间接ELISA法检测PED抗体的方法。KimO等建立了单克隆抗体基础上的免疫组化法，该方法可在福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织中准确而特异的检出PEDV，可用于鉴别诊断TGEV与PEDV。3．2．5RT-PCR法Ishikawa等根据S基因序列设计了一对可扩增目的片段854bp的引物，成功的建立了诊断PEDV的RT-PCR法，可进行细胞毒和粪便毒的检测，灵敏度可达100TCID50mL，并可在8h内测出。Kubota等 1 根据N基因序列设计了一对可扩增目的片段540bp的引物，成功地建立了诊断PEDV的RT-PCR法，可进行细胞毒和粪便毒的检测。在韩国KimO等已建立了TGEV和PEDV的二联RT-PCR诊断方法，可同时检测出10TCID50mL的TGEV和PEDV。KimO等对免疫组化、原位杂交、RT-PCR3种方法进行了比较，认为RT-PCR法检测结果的重复性最好。此外，KimO等]还建立了鉴别TGEV和PEDV的多重巢式RT-PCR法。国内乔宪凤等以PEDV的膜蛋白(M)的RNA为模板，根据Durate等人发表的基因序列，设计3条位于PEDV膜蛋白(M)基因上的引物，进行RT-PCR反应，确立了RT-PCR最适反应条件。4鉴别诊断猪传染性胃肠炎及流行性腹泻皆属于病毒性腹泻病，诊断时要注重与一般条件因素引起的腹泻，饲料因素引起的腹泻，以腹泻为主要症状的传染病，伴有腹泻症状但以其他临床症状为主的疾病进行鉴别诊断。5防治哈尔滨兽医研究所的科研人员研制出猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻
氢氧化铝灭活二联苗，此苗在母猪产前20-30d接种4ml， 仔猪 断奶后10-15d接种一次，免疫效果比较好。此外，刘万钧等在实验室证实了猪白细胞干扰素在Vero细胞培养中和乳猪空肠结扎肠段中对PEDV有明显的干扰作用，还用干扰素对断奶 仔猪 进行PED防治试验取得了良好结果。对猪病毒性腹泻症无特效治疗方法，但为了防止继发感染和脱水造成衰竭，降低死亡率和促进康复，可以采取一些对症疗法。
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