猪精液超低温保存技术
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研究历史及应用用鲜精进行人工授精 人工授精可以说是提高畜禽繁殖率最重要的管理工作。20世纪初，丹麦的种马育种者Sand和Stribolt是最早将人工授精用作商业性工具以最大限度地利用优良种马精液的育种工作者，而俄罗斯研究人员Ivanoff是首位将人工授精技术在马、家禽、牛和
绵羊生产上大规模成功应用的人。 用新鲜精液进行人工授精有众多的好处，包括可以通过控制某些病原体的传播来改善畜禽的健康、提高猪场的生物安全水平，并且由于可以减少公畜(禽)的饲养量而降低生产成本。然而，这项技术的主要益处是，通过利用来自遗传学上的优良种畜(禽)精液给众多的母畜禽)进行授精，使得遗传改良速度得到显著的提高。在这方面，加拿大魁北克省(Quebec)90％左右的商业性生产猪群是用新鲜精液进行人工授精的；l983年至2003年间，肉猪背膘下降7 mm，出生到l00 kg上市体重的饲养期减少了26 d。 超低温保存冷冻精液的潜能 精液的长期保存能给拥有优秀种畜禽的生产者带来额外的好处。自从
甘油可以作为精子的一种高效冷冻保护剂这一里程碑式的发现问世以来，由于甘油在冷冻过程中能够缓和稀释媒介的溶质浓度差，低温保存已成为精液长期保存的最实用方法，并且已经有报道称成功地实现了牛精子的超低温冷冻。虽然每次输精时所需的冷冻精液剂量要多于新鲜精液，但是超低温保存技术大大地促进了农业优良基因的推广，因为冷冻精液能够很方便地进行远距离运输，并能够保存到母畜发情时使用，一份备用的冷冻精液能够使已死亡或生病的供精公畜继续得到使用。 对养猪业更为重要的是，利用冷冻精液将有利于控制某些病原体的传播，从而可保护畜群的健康。超低温保存精液的生物安全保存，能够将突发的传染性疾病和自然灾害(如火灾)所造成的不良影响减至最低程度。此外，公猪及其精液可在传染性病原体上得到有效的筛选。当然，已有报道称，可引起仔猪爆发断奶后多系统衰竭综合征的猪圆环病毒病2型可被排入表面健康的公猪精液内。此病最近已在许多地方，尤其是加拿大、美国和欧洲，越来越受到格外的关注。此外，PCV一2感染在猪群中的流行性远高于PMWS，而且不一定会导致感染猪出现临床症状或不出现由PMWS引发的病变。同样，猪繁殖与呼吸综合征是全球的一种重要疾病。虽然猪繁殖呼吸综合征病毒主要传播是通过与感染猪或污染物的直接接触，但已有证明小母猪用来自PRRS病毒感染公猪的精液进行人工授精(AI)后出现了血清阳转。此外，公猪的病
毒血症和血清学状态不足证明PRRS病毒或PRRS病毒RNA已被排泄入精液中。以上述两种疾病为例，对拥有较高健康水平的养猪场而言，最好在进行人工授精前对特定批次的精液进行筛选。然而，在等待结果期间要求对精液进行低温冷冻保存。 为确保全球的生物安全，成功的猪精液超低温保存是国际市场所不可缺少的。根据陆生动物卫生法典第3.2.2.6条“猪精液的包装和储存适用条件”规定，供出口的猪精液应该盛放在灭菌的烧瓶中并分开保存在液氮中至少28 d。 建立在用流式细胞分选仪分离携带x染色体或Y染色体的精子基础上的性别预选已成为现实，并且通过体外受精和胚胎移植，或使用极低剂量的精液进行子宫内深部输精后，已经产出所需性别的仔猪。研究表明，性别预选技术在养猪生产中的应用将会对育种方案、猪舍设计、营销策略以及繁殖效率产生极大的影响。性别分选精液的超低温保存是商业生产中不可缺少的，此项技术目前已经在牛上建立起来。然而，与性别分选精液相配套的冷冻和处理规程并不太适合于猪的商业性应用，对其它哺乳动物而言也是如此。最后，基因库的有效性取决于超低温保存实用种质的可用性。根据联合国粮食和农业组织的规定，农业生物多样性必须得到保护。该组织的“生物多样性保护条约”规定，其中包括家养动物在内的食品和农业的遗传资源是全球食品安全的生物基础。家畜基因库构成了一个遗传适应性储库，后者在应对环境的变化(如全球变暖、普遍存在的内分泌干扰因子)、疾病、人类营养所需的新物质、变化的市场条件和社会需求(所有这些均是不可预知的)中充当一个缓冲区的角色。不可能仅选择“潜在”重要的特性进行保存。事实上，保留物种的变异性非常重要，特别是商业生产的压力要求生产者减少动物品种的变异性以产出均匀的动物供应市场。商用梅山杂种猪由于引入了原产地中国太湖猪的高繁殖率特性而表现出农业生物多样性的潜力，具有西方猪种的胴体特性。稀有品种组织已经启动了活体动物保存的“寄养农业计划”，但对猪而言此类努力往往不如家禽和小型反刍动物那样成功，因为很难找到愿意寄养猪的农场主。 尽管精液的长期保存具有潜在的优势，但众所周知猪精子对低温非常敏感。甚至经过数十年的研究之后，超低温的精子保存技术继人工授精在商业性养猪生产系统中应用之后仍不足以产生可靠的繁殖力。 精子的功能 精子获能 刚射精的精液是不能进行受精的，首先必须完成获能及渗入卵母细胞前的顶体反应。精子获能广义上是指精子进行功能性修饰，使精子具有与卵子发生受精的能力。在体内，精子获能很大程度会受到雌性生殖道的互作影响，不过包括猪在内的许多动物其精子能够在体外再次获能。因获能引发的功能改变包括精子完成顶体反应所需的能力、所要求将精子从输卵管壁上解脱出来的能力、精子渗入输卵管内及卵丘细胞间粘液的能力和精子穿越透明带的能力。 精子获能受外在因素和内在因素的双重影响，因此一旦受到外源性因子的启动，获能过程似乎会自然而然地继续发生。事实上，获能后的精子极其脆弱，容易产生自发性的顶体反应。 精子细胞膜中胆固醇的去除仿佛是引发精子获能和发生顶体反应的信号通道的最早激活子。胆固醇流出可增强膜的流动性，同时也能改变离子通道的活性，使钙离子和碳酸氢根离子的流动从中获益。钙离子和碳酸氢根离子能直接激活精子内可溶性腺苷酸环化酶，以催化形成cAMP。猪精子中的cAMP形成发生在孵育后的数分钟内，表明导致精子获能的信号通道迅速打开。 精子蛋白的
酪氨酸磷酸化 继发现小鼠精子获能期间许多酪氨酸磷化以cAMP依赖性方式产生后，已在其他动物中记录到了精子获能期间酪氨酸磷蛋白的产生。大多数酪氨酸磷蛋白出现在鞭毛附近，并且很可能参与了精子运动能力的调控和超活化。 猪精子的蛋白质酪氨酸磷酸化在某种程度上不同于已经报道的其它动物精子蛋白质的酪氨酸磷酸化。与精子获能同时发生的是出现了由多种蛋白质组成的迁移至Mr 32 000处的酪氨酸磷蛋白复合体，即为“p32”。猪精子中与其获能有关的酪氨酸磷蛋白位于精子的头部而非鞭毛处，由此暗示其在精子获能、顶体反应或与母猪生殖道之间的相互作用上起着一定的作用。此外，虽然猪精子的获能依赖于碳酸氢盐、钙离子和cAMP，但p32的出现主要取决于钙的浓度。事实上，p32的出现与精子细胞的钙水平和顶体丢失有关，并且很可能代表了一个可导致顶体反应的信号分子。该假设已经得到笔者最近证明p32的一个主要组件是“顶体结合蛋白”(可催化顶体蛋白酶的成熟)的结果所支持。对猪人工授精行业而言，非常有意义的是p32在猪精液冷冻期间出现。 顶体反应 顶体反应是发生在获能精子上的一种细胞外生理活动，它因精子与卵子透明带结合而被激发，期间精子顶体的外膜在与叠加的卵母细胞质膜处多个点上发生膜融合，释放出顶体的内容物，随后使卵子分子暴露在顶体的内膜上。顶体反应使获能精子穿越透明带，从而与卵母细胞受精。 虽然其他信号可能参与了精子的顶体反应，但顶体反应的基本要素是精子细胞内钙离子水平的提高，因为用钙离子载体处理获能精子通常足以诱发胞吐作用。顶体反应的调节似乎包括压力门通钙通道的开放，导致钙离子暂时性内流和细胞内钙离子水平持续增加。最新的研究表明，钙离子会直接与精子细胞内的膜融合装置结合，从而引发顶体反应。精子的顶体反应只有在精子获能以后才能发生；因此，授精的前提是这种现象必须发生在适当的时间和部位。
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