影响
猪肾细胞生长及猪细小病毒增殖的因素浅探
感谢大夫为我快速解答——该如何治疗和防治
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在疫苗生产中，利用细胞增殖病毒制备疫苗，成本低且质量稳定。因此,此工艺在生产中得到了广泛的应用。传代细胞虽然具有生长稳定、均一、快速等优点，但因存在致
肿瘤的可能性等弊端，因此不能大量用于生产。所以，各种原代细胞以安全可靠，得到了大量应用，如犊牛睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞、乳猪肾细胞等。原代细胞由于受诸多因素的影响，生长很不稳定。那么，如何做好细胞培养是企业降低生产成本的关键。笔者在用乳猪肾细胞增殖猪细小病毒时，总结了一些经验供同行参考。1 培养底物的洗涤：一般培养猪肾细胞的底物多采用转瓶，材质有塑料或玻璃的。本试验采用10000mL玻璃转瓶培养。用洗涤剂进行洗涤，不采用酸碱浸泡，因酸碱浸泡的物品有残留，对细胞的生长会有较大的影响。在多次生产试验中，细胞生长良好，贴壁效果较为理想。2 供体仔猪日龄：仔猪日龄越小，细胞分化越好，繁殖能力越强。在生产猪肾原代细胞时，我们分别选取1、3、5、7、9、11、13日龄的健康仔猪各2头，每头猪肾制备2个转瓶,相同条件培养，观察细胞长成单层的速度和形成单层后进行1∶5传代细胞的生长速度。结果用1、3、5、7日龄仔猪肾制备的猪肾原代和次代细胞生长成单层的速度无显著差别；用9、11、13日龄仔猪肾制备的原代细胞生成单层的时间较前者平均慢1~2 d,利用9日龄猪肾制备的次代细胞长成单层时间较长，用11、13日龄仔猪肾制备的次代细胞生长不好，不能形成单层。3 仔猪生理状况：用于生产猪肾细胞的仔猪应健康，不应感染有传染病；身体不健康直接影响原代细胞的生长活力。4 细胞营养液：乳汉液按《兽用生物制品制造及检验规程》（2000版)规定的方法制备，应注意以下几点。4.1 称取各种试剂药品要准确，严格按规程要求的方法按顺序称取，不得将物品的顺序颠倒。溶解时要等先加入的试剂溶解了再加入另一种试剂，甲液和乙液配好后，要将乙液缓缓加入到甲液中并混合均匀。然后按要求加入水解乳蛋白。4.2 乳汉液培养液配好后，应检验溶液的缓冲系统是否具有缓冲能力，如缓冲效果不好或不具有缓冲的能力应将其弃之，重新配制。5猪肾细胞的制备 (1)猪肾组织块的制备：无菌摘取乳猪肾，除去包膜和肾的髓质，尽量将其去净，因过多的髓质会影响细胞的生长。做好后，用乳汉液洗涤2~3次，用无菌的剪子将其剪成1~2 mm的小块后，再洗涤2~3次，洗至液体澄清为止。(2)细胞消化与分散：在细胞消化时，液体的pH应调至略碱性，效果较好。消化时间不应将预热时间计算在内。消化时间一般为30~50 min，并视消化程度而定。消化期间要振摇数次。待组织块周围有30%左右出现絮状物时，就已消化好了，不能等完全出现絮状物时再停消。这时就已消化过重，细胞的细胞膜就已部分被破坏。死细胞较多，不利于细胞生长。 细胞分散目前多采用玻璃珠摇动使其分散，摇时用力不要太大。防止在培养时死细胞过多，会产氨使液体的酸碱度升高，不利于细胞生长。此外用纱布滤过时，纱布的层数不要过多，2~3层纱布即可，因为“细胞团”生长一般较好。此外组织也可多次消化，效果一般较好，但较繁锁易造成污染。(3)转瓶培养速度：原代细胞培养一般转瓶的速度为6~10 r/h。在生产中一般慢速比快速贴壁的效果好，先慢速后快速的效果会更好，贴壁后，一般快速比慢速细胞生长好。原代细胞的贴壁时间一般为10多个小时左右，次代细胞的生长速度较快，多在3~5 h，操作者可以根据需要调整转瓶机的转速来达到最佳的贴壁效果。6 猪细小病毒的增殖(1)猪细小病毒的接毒时间，应待猪肾原代细胞有30%~50%生长为细胞单层时接毒，也有同步接毒的，但效果不好。细胞少比细胞多时产毒效果好，收获的病毒液毒价高。我们为了比较其产毒效果，分别取20%、30%、40%、50%、60%生成单层的猪肾细胞转瓶各2瓶。相同条件培养增毒测其病毒液效价见表1表1乳猪肾原代细胞和次代细胞的增毒效价细胞类别 病毒液效价1 病毒液效价220% 1∶128 1∶25630% 1∶512 1∶51240% 1∶512 1∶51250% 1∶512 1∶25660% 1∶128 1∶64(2)猪细小病毒（PPV)的体外复制是杀细胞性的，主要表现为细胞隆起、固缩、溶解。适应了细胞培养的病毒在适宜条件下生长时，能使细胞产生广泛的病变。但在，最初分离病毒时，在没有见到细胞病变（CPE)时，应将病毒，更确切的说，应将受感染的细胞培养物连传几代。免疫荧光显微镜的使用大大提高了细胞培养物中微量PPV的检出率。虽然有几种细胞用作增殖和滴定PPV是敏感的，但最常用还是胎儿或新生猪的原代或次代细胞。通过对正处在分裂期的细胞培养物进行感染，由于当培养物中很多细胞处于其分裂周期的S期（即DNA合成期)时，病毒可获得复制所需要的细胞源性DNA聚合酶。将有助于PPV的复制。(3)如果将胎儿或成年牛的血清用于PPV繁殖的细胞培养物中，应预先测定其中是否含有病毒抑制因子。另外，对所有的细胞培养物也应检查有无PPV的污染。(4)利用免疫荧光显微镜检查细胞培养物中PPV的增殖情况。一般情况下，该病毒的复制情况如下：如果接种物中含有高滴度的病毒和病毒抗原，很快就能从感染细胞的胞浆中查到病毒抗原，这种早期细胞的荧光大多数是由于细胞直接吞噬了接种物中的抗原产生。连续检查发现，这些抗原首先在细胞膜外表面出现，然后见于细胞浆，通常相对集中见于靠近细胞核的位置。病毒复制的最早，最明确的证据是新产生的病毒抗原出现在核内。随后，至少一部分感染细胞的胞浆内出现大量的新合成的抗原，致使细胞浆和细胞核都带有明亮的荧光。受感染的细胞随后隆起、固缩、裂体并释放出病毒和病毒抗原。培养物中其他处于不适宜病毒复制阶段的细胞则继续向胞浆内吞噬，
积聚病毒抗原。如果刺激这些细胞进入S期，如通过加入新鲜培养液，则可以诱导出第二个病毒复制高峰。(5)血凝试验（HA)：通常在室温下进行，pH接近中性，使用豚鼠红细胞。据记载，
巴比妥缓冲液比磷酸盐缓冲液作稀释液得到的HA滴度更高（Rucker Bauer等，1978)。
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