猪瘟,猪繁殖与呼吸综合征猪圆环病毒2型混合感染
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2005年底江苏某猪场饲养的商品肉猪群中部分猪只陆续发生高热、皮肤发绀、呼吸困难等症状，病程一般持续5～7天，发病猪一般以死亡为转归，发病猪在濒死前发生全身
抽搐等神经症状。不同年龄段的猪群中均有不同程度的发生，临床表现基本相似。通过临床病理剖检和实验室诊断相结合的方法，诊断为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征，猪圆环病毒2型混合感染。1 材料与方法 1.1 细菌培养基 巧克力培养基、绵
羊血平板均按常规方法制备。1.2 荧光抗体 FITC标记的猪瘟荧光抗体购自中国兽医药品监察所。1.3 PCR引物 猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)特异的PCR引物参照Gilbert等的方法合成，引物序列为：PRRSVF：5′CCTCCTGTATGAACTTGA3′；PRRSVF：5′AGGTCCTCGAACTTGAGCTG3′。猪圆环病毒2型（Porcing circovirus type 2，PCV2)特异的PCR引物参照Larochelle等的方法合成，引物序列为：PRRSVF：5′TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT3′；PRRSVF：5′CCGCACCTTCGGATATACTG3′。〖KG-6〗所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1.4 分子生物学试剂 MMLV反转录酶购自Promega 公司；dNTP、RNAsin、Taq DNA聚合酶、等购自大连TaKaRa公司；Trizol购自上海生工生物工程有限公司；100bp DNA 梯度Marker购自MBI公司。1.5 病料采集 对部分发病比较严重的或刚刚死亡的猪进行仔细剖检，分别采集鼻腔分泌物、
心包液、心血、心、肝、脾、肺、肾等病料，供实验室检测用。1.6 细菌学检验 将采集的鼻腔分泌物、心血、
心包积液分别涂片，革兰氏染色后进行显微镜检查。同时将心血和心包积液接种
绵羊血平板和巧克力琼脂，37℃培养48 h观察结果。1.7 猪瘟抗原检测 采用间接免疫荧光试验法，取病、死猪的扁
桃体、淋巴结、脾进行组织触片，自然干燥后用冷丙酮-20℃固定20 min，再用PBS（pH7.2)洗涤3次，每次5 min，滴加猪瘟荧光抗体，37℃湿盒作用30 min，用PBS洗涤3次，每次5 min，干后滴加
甘油缓冲液封片，荧光显微镜检查。1.8 PRRSV和PCV2的PCR检测1.8.1 核酸提取 病料RNA和DNA用Trizol试剂提取，按照说明书提供的方法进行。首先将病料剪碎，用研磨器匀浆后制成1∶10悬液，取100 μl样品加入1 ml Trizol试剂，混匀后室温作用5 min，加入200 μl氯仿，振荡混匀后室温作用5 min，12 000 r/min离心5 min，将上清移入新的灭菌指形管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置5 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清，用70%
乙醇洗涤沉淀两次，室温吹干，用30 μl DEPC处理的灭菌超纯水溶解沉淀。一半用PRRSVR引物进行反转录，另一半直接用作PCV2的PCR检测。1.8.2 反转录 反转录体系为25 μl，其中含5×MMLV缓冲液5 μl，RNA 12.5 μl，2.5 mmol dNTP 5 μl，PRRSVR引物1 μl，RNAsin 0.5 μl，MMLV反转录酶1 μl。混匀后，37℃作用1 h，95℃作用5 min灭活MMLV反转录酶。1.8.3 PCR试验 PCR反应体系为25 μl，其中含10×Taq DNA聚合酶缓冲液2.5μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，模板2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，灭菌超纯水18 μl。PRRSV检测PCR反应条件为：94℃预变性3 min后，94℃ 20 s、42℃ 1 min、72℃ 1 min进行1个循环，然后94℃ 20 s、47℃ 1 min、72℃ 1 min进行40个循环，最后72℃ 15 min。PCV2检测PCR反应条件为：95℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min进行35个循环，最后72℃ 10 min。〖JP〗1.8.4 电泳 PCR反应结束后，取10 μl PCR产物加入2 μl 6×上样缓冲液用2%琼脂糖凝胶进行电泳，用100 bp DNA梯度Marker作为参照。PRRSV和PCV2的预期PCR产物大小分别为255 bp和263 bp。2 结果 2.1 剖检表现 所有猪均表现为肺充血、出血和间质性
肺炎，脾脏肿大，肾脏色淡，少数猪有心包积液和鼻腔黏液。2.2 细菌学检查结果 心血和心包液染色镜检后未见有细菌，鼻腔分泌物中也未见可疑细菌，心血和心包液接种绵羊血平板和巧克力琼脂也未见有细菌生长。2.3 猪瘟抗原检测结果 将病料组织触片后通过荧光抗体染色后，在荧光显微镜下可见完整细胞胞浆内有大量黄绿色荧光，结果见图1。2.4 PCR检测结果 PCR产物电泳检测结果表明，PRRSV和PCV2 PCR检测产物大小分别255 bp和263 bp，与预期大小相符，结果见图2。3 讨论与分析 3.1 随着我国养猪业集约化程度的提高，种猪和生猪跨地域运输越来越频繁，使得猪群传染病的发生越来越复杂。在很多猪场，都同时存在多种病原的混合感染。本文所报道的猪场经过诊断，同样也是被确诊为猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型3种病毒的混合感染。3.2 该场引进每一批猪后，均及时用5倍剂量的猪瘟
兔化弱毒疫苗进行免疫，但是仍然发生了猪瘟疫情，原因可能有：(1)由于免疫猪的免疫状况背景不清楚，可能在引进前抗体水平较低，甚至已经发生了猪瘟病毒的感染。(2)根据现阶段的猪瘟流行的严重程度，很多猪场所采取的免疫程序中，均安排了多次猪瘟疫苗的免疫接种，而该场仅在引进后进行了一次免疫接种，因而可能不能产生坚强的免疫力。(3)该场还同时存在猪繁殖与呼吸综合征和圆环病毒2型的混合感染，而这两种病毒根据现有的研究结果表明，感染后均能够造成宿主的的免疫抑制，因此可能会感染猪瘟疫苗免疫效力的发挥，而且该场并未接种除猪瘟疫苗以外的其他疫苗，因而对猪繁殖与呼吸综合征等疾病高度易感。3.3 针对该场的现状，笔者建议：(1)暂停从引进外来猪只，对已经发病的猪只进行扑杀和严格的无害化处理，对同群猪用猪瘟兔化弱毒苗和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗进行紧急接种，加强环境卫生和定期消毒。(2)在所有猪只都出栏后，全场彻底消毒，并空场2～3个月以上。(3)逐步建立自繁自养制度。(4)不同年龄的猪分群饲养并固定专人管理。(5)制定合理的免疫程序。该场在采纳了上述的建议后，猪场发病率逐渐下降。
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2005年底江苏某猪场饲养的商品肉猪群中部分猪只陆续发生高热、皮肤发绀、呼吸困难等症状，病程一般持续5～7天，发病猪一般以死亡为转归，发病猪在濒死前发生全身抽搐等神经症状。不同年龄段的猪群中均有不同程度的发生，临床表现基本相似。通过临床病理剖检和实验室诊断相结合的方法，诊断为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征，猪圆环病毒2型混合感染。1 材料与方法 1.1 细菌培养基 巧克力培养基、绵羊血平板均按常规方法制备。1.2 荧光抗体 FITC标记的猪瘟荧光抗体购自中国兽医药品监察所。1.3 PCR引物 猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)特异的PCR引物参照Gilbert等的方法合成，引物序列为：PRRSVF：5′CCTCCTGTATGAACTTGA3′；PRRSVF：5′AGGTCCTCGAACTTGAGCTG3′。猪圆环病毒2型（Porcing circovirus type 2，PCV2)特异的PCR引物参照Larochelle等的方法合成，引物序列为：PRRSVF：5′TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT3′；PRRSVF：5′CCGCACCTTCGGATATACTG3′。〖KG-6〗所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1.4 分子生物学试剂 MMLV反转录酶购自Promega 公司；dNTP、RNAsin、Taq DNA聚合酶、等购自大连TaKaRa公司；Trizol购自上海生工生物工程有限公司；100bp DNA 梯度Marker购自MBI公司。1.5 病料采集 对部分发病比较严重的或刚刚死亡的猪进行仔细剖检，分别采集鼻腔分泌物、心包液、心血、心、肝、脾、肺、肾等病料，供实验室检测用。1.6 细菌学检验 将采集的鼻腔分泌物、心血、心包积液分别涂片，革兰氏染色后进行显微镜检查。同时将心血和心包积液接种绵羊血平板和巧克力琼脂，37℃培养48 h观察结果。1.7 猪瘟抗原检测 采用间接免疫荧光试验法，取病、死猪的扁桃体、淋巴结、脾进行组织触片，自然干燥后用冷丙酮-20℃固定20 min，再用PBS（pH7.2)洗涤3次，每次5 min，滴加猪瘟荧光抗体，37℃湿盒作用30 min，用PBS洗涤3次，每次5 min，干后滴加甘油缓冲液封片，荧光显微镜检查。1.8 PRRSV和PCV2的PCR检测1.8.1 核酸提取 病料RNA和DNA用Trizol试剂提取，按照说明书提供的方法进行。首先将病料剪碎，用研磨器匀浆后制成1∶10悬液，取100 μl样品加入1 ml Trizol试剂，混匀后室温作用5 min，加入200 μl氯仿，振荡混匀后室温作用5 min，12 000 r/min离心5 min，将上清移入新的灭菌指形管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置5 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀两次，室温吹干，用30 μl DEPC处理的灭菌超纯水溶解沉淀。一半用PRRSVR引物进行反转录，另一半直接用作PCV2的PCR检测。1.8.2 反转录 反转录体系为25 μl，其中含5×MMLV缓冲液5 μl，RNA 12.5 μl，2.5 mmol dNTP 5 μl，PRRSVR引物1 μl，RNAsin 0.5 μl，MMLV反转录酶1 μl。混匀后，37℃作用1 h，95℃作用5 min灭活MMLV反转录酶。1.8.3 PCR试验 PCR反应体系为25 μl，其中含10×Taq DNA聚合酶缓冲液2.5μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，模板2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，灭菌超纯水18 μl。PRRSV检测PCR反应条件为：94℃预变性3 min后，94℃ 20 s、42℃ 1 min、72℃ 1 min进行1个循环，然后94℃ 20 s、47℃ 1 min、72℃ 1 min进行40个循环，最后72℃ 15 min。PCV2检测PCR反应条件为：95℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min进行35个循环，最后72℃ 10 min。〖JP〗1.8.4 电泳 PCR反应结束后，取10 μl PCR产物加入2 μl 6×上样缓冲液用2%琼脂糖凝胶进行电泳，用100 bp DNA梯度Marker作为参照。PRRSV和PCV2的预期PCR产物大小分别为255 bp和263 bp。2 结果 2.1 剖检表现 所有猪均表现为肺充血、出血和间质性肺炎，脾脏肿大，肾脏色淡，少数猪有心包积液和鼻腔黏液。2.2 细菌学检查结果 心血和心包液染色镜检后未见有细菌，鼻腔分泌物中也未见可疑细菌，心血和心包液接种绵羊血平板和巧克力琼脂也未见有细菌生长。2.3 猪瘟抗原检测结果 将病料组织触片后通过荧光抗体染色后，在荧光显微镜下可见完整细胞胞浆内有大量黄绿色荧光，结果见图1。2.4 PCR检测结果 PCR产物电泳检测结果表明，PRRSV和PCV2 PCR检测产物大小分别255 bp和263 bp，与预期大小相符，结果见图2。3 讨论与分析 3.1 随着我国养猪业集约化程度的提高，种猪和生猪跨地域运输越来越频繁，使得猪群传染病的发生越来越复杂。在很多猪场，都同时存在多种病原的混合感染。本文所报道的猪场经过诊断，同样也是被确诊为猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型3种病毒的混合感染。3.2 该场引进每一批猪后，均及时用5倍剂量的猪瘟兔化弱毒疫苗进行免疫，但是仍然发生了猪瘟疫情，原因可能有：(1)由于免疫猪的免疫状况背景不清楚，可能在引进前抗体水平较低，甚至已经发生了猪瘟病毒的感染。(2)根据现阶段的猪瘟流行的严重程度，很多猪场所采取的免疫程序中，均安排了多次猪瘟疫苗的免疫接种，而该场仅在引进后进行了一次免疫接种，因而可能不能产生坚强的免疫力。(3)该场还同时存在猪繁殖与呼吸综合征和圆环病毒2型的混合感染，而这两种病毒根据现有的研究结果表明，感染后均能够造成宿主的的免疫抑制，因此可能会感染猪瘟疫苗免疫效力的发挥，而且该场并未接种除猪瘟疫苗以外的其他疫苗，因而对猪繁殖与呼吸综合征等疾病高度易感。3.3 针对该场的现状，笔者建议：(1)暂停从引进外来猪只，对已经发病的猪只进行扑杀和严格的无害化处理，对同群猪用猪瘟兔化弱毒苗和猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗进行紧急接种，加强环境卫生和定期消毒。(2)在所有猪只都出栏后，全场彻底消毒，并空场2～3个月以上。(3)逐步建立自繁自养制度。(4)不同年龄的猪分群饲养并固定专人管理。(5)制定合理的免疫程序。该场在采纳了上述的建议后，猪场发病率逐渐下降。
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