猪干扰素基因研究进展及其在抗病育种中的应用展望
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摘要：干扰素是动物机体最重要细胞因子之一，目前计有5种猪干扰素（I型干扰素α、β、ω、δ和II型干扰素γ)被发现。本文列举了主要猪干扰素（INFα、β、γ)的基因结构、抗病毒和免疫调节功能，概述了干扰素在机体中以JAK-STAT信号转导通路方式为主的抗病毒机理，同时分析了猪干扰素基因可能存在与猪综合抗病力密切相关的遗传多态性及其在猪抗病育种中的应用前景。 关键词：猪；干扰素基因；综合抗病力；遗传多态性 1、前言 1957年Isaacs和Lindenman在进行鸡胚细胞流感病毒感染试验中首次发现一类能干扰和抑制病毒复制的可溶性细胞分泌物，故取名为干扰素（interferon)。Wheelock与Green分别于1965年和1969年相继发现免疫活性细胞经丝裂原或抗原刺激后，产生一类对酸敏感的干扰素，称为免疫干扰素。目前依据干扰素对酸的敏感性通常分为I型干扰素（酸敏感型)和II型干扰素（耐酸型)两类。几乎所有脊椎动物均可产生这两类干扰素，根据产生干扰素细胞种类不同，I型干扰素至今已发现INF-α、β、ω、κ、τ、δ等6种类型，而II型干扰素迄今为止仅发现INF-γ一种（Domeika, 2003)。由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研究最为活跃的领域之一。 2、猪干扰素及其基因结构 目前所发现的猪干扰素包括INF-α、β、ω、δ和INF-γ，并且INF-δ未在其它物种中发现（Domeika, 2003)。猪INF-α、ω分别是由12个和5个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族，这些两种干扰素的各亚型之间同源性很高，天然INF-α常常是INF-α、ω功能基因表达产物的混合体，而INF-β、δ和INF-γ仅由单一基因编码（Bonnardiere, et al., 1994)。现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括INF-α、β、ω和INF-γ，汇总如下： 3、干扰素作用机理 3.1、干扰素主要生物学功能 3.1.1、干扰素作用特点 作为机体最重要的细胞因子之一，干扰素主要生物学功能体现为广谱的抗病毒活性和免疫调节功能，其作用特点可概括为（杨业华主编，2000；周光炎主编，2000)：1、干扰素属诱生蛋白，正常细胞一般不自发产生干扰素，在受诱生剂（包括病毒、细菌和某些化学合成物质)激发后，干扰素基因去抑制而表达；2、干扰素系统是目前所知的发挥作用最快的第一病毒防御体系，可在很短时间（几分钟内)使机体处于抗病毒状态，并且机体在1-3周时间内对病毒的重复感染有抵抗作用；3、干扰素的抗病毒效应是通过与靶细胞受体结合，诱导抗病毒蛋白（AVP)而间接发挥作用，对病毒起抑制作用而非杀灭；4、干扰素具有种属特异性，并且不同病毒、不同细胞对干扰素敏感性不同；5、I型和II型干扰素发挥不同效应，不能相互替代。 3.1.2、干扰素主要生物学功能 目前对INF-α、β、γ生物学功能和作用机理研究报道较多，I型和II型干扰素来源不同（INF-α主要由单核巨噬细胞产生，INF-β来源于成纤维细胞，而INF-γ主要产生于αβT细胞、γδT细胞和NK细胞)，挥发的生物学效应存在一定差异。干扰素的主要生物学功能可概括为（Samuel,2001)：1、广谱抗病毒功能：I型和II型干扰素基因均可经诱导剂激活而表达，表达产物通过特定信号转导通路，激活干扰素诱导基因的转录，机体合成多种具阻断病毒复制功能的抗病毒酶和蛋白质，抵抗病毒对机体细胞的感染；2、免疫调节功能：I型干扰素可增强MHC-I类分子表达，而强烈抑制MHC-II类分子表达；II型干扰素可促进MHC-II类分子表达，两类干扰素的协同调节作用，使机体处于最佳免疫应答状态。此外INF-γ的生成可促进Th0细胞向Th1分化，而抑制Th2的生成，由于Th1和Th2分别介导机体细胞免疫和体液免疫，因此INF-γ可根据不同病原感染，与其它细胞因子（如IL-4等)共同作用，对机体进行免疫干预，实现免疫系统防御功能。3、免疫增强功能：I型和II型干扰素均可刺激NK细胞并增强其杀伤功能，有利于机体清除病毒感染；此外INF-γ是主要的巨噬细胞活化因子（macrophage-activating factor，MAF)，促进巨噬细胞吞噬能力和炎症反应，并可直接促进T、B细胞分化和CTL成熟，刺激B细胞分泌抗体，从而增强机体免疫机能。 3.2、干扰素抗病毒机理 干扰素基因的激活和表达是机体第一道病毒防御体系，它先于机体的免疫应答反应。虽然干扰素还具其它多种生物学功能（如对免疫系统的调控、影响细胞生长、分化和凋亡等)，但干扰素对入侵病毒的非特异性抑制功能，对于许多疾病的预防和治疗意义重大。 根据对人和小鼠的相关研究，干扰素对病毒的防御反应主要是通过信号转导和转录激活通路，导致一系列受干扰素调控基因表达，生成多种直接作用于入侵病毒的酶和蛋白质，保护机体免受感染,其中JAK-STAT通路是干扰素介导的信号转导和转录激活的主要方式（Samuel,2001)。JAK为Janus家族的蛋白
酪氨酸激酶，包括Jak-1、Jak-2、 Jak-3、 Tyk-2，STAT（signal transducer and activator of transcription)即细胞转导与转录激活因子（包括STAT-1、STAT-2、STAT-3、STAT-4、STAT-5a、STAT-5b、STAT-6)，其中Jak-1、Jak-2、 Tyk-2与STAT-1、STAT-2直接参与了干扰素介导的JAK-STAT信号转导通路。JAK-STAT通路具体过程可表示为（周光炎主编，2000；Samuel,2001)：（1)首先从受诱导表达的INF-α/β和INF-γ分别与异构二聚体受体INFAR1-INFAR2和INFGR1-INFGR2的胞外区结合开始，由此激活与两种受体胞内区相连的蛋白酪氨酸激酶Jak-1、Tyk-2与Jak-1、Jak-2；（2)STAT-1、STAT-2在Jak-1、Tyk-2催化作用下，使蛋白链特定位置的酪氨酸磷酸化并形成异二聚体，再与干扰素调节因子-9（INF-9)形成三聚体，而两分子的STAT-1在Jak-1、Jak-2作用下形成同源二聚体；（3)形成的三聚体和同源二聚体分别与染色体的ISRE元件和GAS元件结合，从而激活各种抗病毒基因启动子，生成多种抗病毒蛋白，参与机体的病毒防御快速反应。 由干扰素诱导生成的抗病毒蛋白主要包括：（杨业华主编，2000；Samuel,2001)（1)双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR，常称为P1/eIF-2α)，主要功能为阻断宿主细胞mRNA合成病毒蛋白质；（2)2'，5'腺苷酸合成酶（2',5'-oligoadenylate synthetase，OAS)，主要功能为激活内源性RNase L，活性RNase L可降解病毒mRNA；（3)腺苷脱氨酶I（adenosine deaminase 1，ADAR1)，可将病毒RNA中碱基A修饰为I而阻止病毒蛋白质合成；（4)Mx蛋白（一种GTP结合蛋白)，可与病毒核蛋白结合而损伤病毒衣壳蛋白；（5)氮氧化物合成酶（nitric oxide synthase，NOS)，可使机体产生NO，NO在免疫防卫中可发挥重要作用。 4、干扰素基因在猪抗病育种中的应用展望 4.1、畜禽抗病力性状的遗传基础 畜群对大多数疾病的抗性与其他重要经济性状同属数量性状，受微效多基因与环境的共同影响（Axford et al.，2000)。研究表明畜禽对多数呼吸道、消化道类疾病的抗病力性状存在加性遗传方差：Lundheim通过估计公畜遗传方差组分，估计瑞典猪群对呼吸道疾病易感性h2为0.14，
萎缩性鼻炎易感性h2为0.16（1979)；肠道疾病的h2为0.59（1988)。Pryztulski and Porzeczkowska (1980)估计了猪对螺旋体的抗病力h2为0.20-0.21；Bumstead et al.（1991)分析了8个不同鸡的近交系试验对7种不同种球虫、沙门氏杆菌、大肠杆菌、马立克氏病毒、传染性支气管炎病毒以及5种禽
白血病病毒的抗性，结果表明，各种近交系对病原的抗性均存在差异，结果表明畜禽抗病力大多受多基因及环境效应共同影响。 尽管数量性状的多基因效应为开展猪特定病原抗病力选育奠定了理论基础，但在育种实践中至今仍存在待以解决的问题，具体表现为：（1)对特定疾病抗性的直接选择所耗费的成本和对生产造成的损失极其巨大；（2)选择对某种病原的抗性可能导致对其它病原的易感性；（3)对特定病原的抗性的间接选择，实质上导致对病原本身生存力的同步正向选择，进而阻碍了畜禽抗病力的选择效果（Gandon et al.,2001)。 因此对畜禽先天的、无病原特异性的综合防御能力—综合抗病力的选择成为畜禽抗病育种研究的重要内容，而寻找控制综合抗病力主效基因（QTL)或遗传标记，是开展畜禽综合抗病力选育重要手段。 4.2、干扰素与抗病力的关系 干扰素强大的抗病毒和多种免疫调节功能，使得干扰素基因有可能成为猪抗病力选育的理想侯选基因。迄今为止，有关猪干扰素基因的遗传多态性与综合抗病力的相关分析的研究仍未见报导。但有关人类疾病与干扰素基因多态性相关分析的研究报道对今后开展猪抗病力选育的研究具一定借鉴作用：如不同IFN-γ基因型与日本国内肾病的易感性显著相关（Masutani et al.,2003)；IFN-γ基因存在一与人
肺炎易感群有关的单核苷酸标记（Lopez-Maderuelo et al，2003)；人对乙肝病毒的易感性与IFN-γ基因表达量差异有关（Ben-Ari et al.，2003)；Lio et al.（2002)、Stassen et al.（2002)、Lu et al（2002)也报导了类似研究结果。 此外，大量体内和体外试验表明，猪干扰素对生产具重大威胁的传染病病毒均具有防御和抑制作用。一系列体外试验表明：用IFN-γ处理感染PRRSV(繁殖与呼吸综合征病毒)的猪巨噬细胞，可抑制PRRSV增殖（Bautista & Molitor，1999)；用重组interferon-γ处理Marc-145细胞后，可抑制PRRSV野毒株和细胞适应性毒株增殖（Rowland ，2001)；猪IFN-α/β能有效抑制
口蹄疫病毒的活力（Chinsangaram et al.，1999)；:猪重组IFN-γ可抑制感染传染性胃肠炎冠状病毒的猪上皮细胞和肺巨噬细胞中病毒复制（Charley B, et al，1988)；猪INF-γ可抑制感染猪瘟病毒的单核细胞和肺巨噬细胞的病毒复制（Esparza et al,1988)。动物体内试验表明，同时注射猪瘟疫苗和干扰素，可增强对猪瘟病毒的防御能力（Suradhat，et al. 2001)；感染TGEV的仔猪，可在肠道上皮组织中迅速产生抗TGEV的IFN-α（Riffault et al.，2001)。 4.3、展望 基于上述研究报导，猪干扰素对许多重大传染病致病病毒具有效的防御功能，以及人类干扰素基因存在与疾病易感性相关的多态性，可以推测猪干扰素基因存在与猪综合抗病力相关的遗传多态性，有可能在猪抗病育种研究中作为理想的侯选主效基因，但开展相关研究的前提是需要对综合抗病力指示表型性状进行筛选和确立和准确测定。 畜禽抗病育种研究方兴未艾，免疫学和分子生物学理论和技术的日新月异将进一步促进畜禽抗病育种技术发展和完善。
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