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六、蛋白质的分离与纯化:
1.盐析与有机溶剂沉淀:在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析。常用的中性盐有:硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀。
2.电泳:蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。
3.透析:利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开。
4.层析:利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相(固定相与流动相)之间的分布不同而进行分离。主要有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。
5.超速离心:利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。
七、氨基酸顺序分析:
蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析,即蛋白质一级结构的测定,主要有以下几个步骤:
1. 分离纯化蛋白质,得到一定量的蛋白质纯品;
2. 取一定量的样品进行完全水解,再测定蛋白质的氨基酸组成;
3. 分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸;
4. 采用特异性的酶(如胰凝乳蛋白酶)或化学试剂(如溴化氰)将蛋白质处理为若干条肽段;
5. 分离纯化单一肽段;
测定各条肽段的氨基酸顺序。一般采用Edman降解法,用异硫氰酸苯酯进行反应,将氨基酸降解后,逐一进行测定;
7. 至少用两种不同的方法处理蛋白质,分别得到其肽段的氨基酸顺序;
8. 将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较,以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序。
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