实验动物科学:第十节　病毒学研究中实验动物的选择与应用

一、病毒学研究中实验动物的选择

病毒学研究常选用的实验动物有金黄地鼠、小白鼠、豚鼠、家兔、绵羊、禽类、猴等。分离病毒广泛使用的是乳鼠，它对柯萨基病毒、呼吸道肠道病毒和虫媒病毒感染有高度易感性。许多柯萨基病毒A型直到目前仍然不能在1月龄小白鼠以外的任何非人的宿主中培养。因此，目前研究虫媒病毒常选用小白鼠乳鼠及刚断乳的幼鼠，A型柯萨基病毒需用出生一天内的小白鼠培养。用感染乳鼠脑制备补体结合抗原，滴度常较高且非特异性仅应较少。

其他实验动物，如成年小白鼠、兔、豚鼠、雪貂在人类病毒学的发展史上曾起过关键性作用，但目前它们主要用来研究病理机制、制备诊断用品等，并不用于分离病毒。灵长类动物广泛用于致病性研究，特别是可能由“慢病毒”感染引起的一些疾病。

选用作病毒学研究的实验动物，应首先考虑采用该病毒的易感动物。不同病毒的易感动物与接种途径见表10-48。

表10-48　各种病毒常用易感动物与接种途径

在进行肿瘤病毒研究时要注射选择病毒的自然宿主和实验宿主动物。因为病毒与肿瘤关系主要来源于实验动物的研究，实验动物的选择很重要。动物肿瘤病毒因所含核酸不同而分为两类，即RNA肿瘤病毒和DNA肿瘤病毒。RNA肿瘤病毒有三种电镜形态，称为A型、B型和C型。最常见的为C型颗粒。DNA病毒中，有多种能引起动物肿瘤。其大小不一，最大的病毒如痘病毒、疱疹病毒、传染性软疣病毒，最小的病毒如多瘤病毒。动物DNA、RNA肿瘤病毒的自然宿主和实验宿主情况见表10-49和表10-50。

表10-49　动物RNA肿瘤病毒

表10-50　动物DAN肿瘤病毒

二、常见病毒敏感动物的选择

病毒敏感动物的研究，一直是病毒学中的重要内容之一。实验动物在人类病毒学发展史上曾起过重要作用，主要用作分离病毒、研究发病机制、抗病毒药物筛选、疫苗效果及完全性鉴定、制备诊断用品等。

实验动物选择，应注意影响动物实验效果的各种因素。不同种属动物对同一致病因素的易感性不同，对一种动物是病原体，对另一动物可能并不致病。即使是同一种属动物的不同品系，对同一刺激的反应也有很大差异。年龄、体重、性别、生理状态、健康情况，往往导致对同一刺激的不同结果。此外，病毒学研究中，接种途径的改变往往导致不同的感染结果。实验中，应尽量利用经微生物控制的动物和纯种动物。

表10-51　各种病毒在鸡胚内的繁殖与接种途径

（一)RNA病毒敏感动物

1．披盖病毒科

⑴黄热病毒：黄热病毒是披盖病毒科、黄热病毒属（B组虫媒病毒)的原型。所有灵长类可能都易感，其中非洲种类抵抗力较高，只有隐性感染或很轻的非致死症状，而南美及西印度群岛的猴敏感得多。最为敏感的动物是恒河猴，另外可用中国猴（Macacus　Sinicus)及断尾猴（M.Speciosus　Thibetanus)。小白鼠对黄热病毒也敏感，令人感兴趣的是：纯血清接种的小白鼠尚能很好存活，而以稀释血清接种的小白鼠却于较短时期内死亡。这一奇特现象的理由，可能是由于病人体内血清抗体早期出现之故。应用纯血清时，这些抗体中和了病毒的作用，而当应用稀释的血清时，抗体浓度不足，但病毒在稀释后仍然具有活力。

⑵登革病毒：登革病毒属披盖病毒科中的黄病毒属，小白鼠往往是经常应用唯一实验动物。有几株病毒已对其适应，特别是对新生小白鼠。1～2日龄乳鼠和仓鼠脑内注射病毒后死亡。病毒对小白鼠的适应过程如下：接种年龄2～3周的小白鼠，最好选用abc种，一部分小白鼠接受未经稀释的血清，另一部分则接受稀释至1：100的血清，观察5～6周，杀死明显有麻痹或脑膜炎征象的小白鼠，以其脑组织制或悬液接种于其人它小白鼠。

猴对登革病毒易感，很多种猕猴，食蟹猴，长尾猿，狒狒都可因蚊虫叮刺或注射病毒而受到感染。基本是无症状的隐性感染，但接种后1～7天内有病毒血症，有人报告有轻度白细胞减少。

小鸡、晰蜴、新生或成年豚鼠、兔、仓鼠或棉鼠实验接种后不发生疾病。

个别报告称脑内或鼻腔内接种可使日本黄鼠死亡，未能被证实。

⑶乙脑病毒：乙脑病毒属于披盖病毒科黄热病毒属的B组虫蝶病毒。

实验室内，乳鼠和成年小鼠鼠脑内接种后发生致死性脑炎，腹腔内接种后乳鼠发生致死性脑炎，只有几种小鼠株的成年小鼠发生致死性脑炎。恒河猴、食蟹猴和成年仓鼠脑内接种后发生致死性脑炎，但周围途径接种时只发生无症状的病毒血症。豚鼠和兔脑内或周围接种，蝙蝠、小鸡、和苍鹭周围接种后都只发生无症状的病毒血症。蝙蝠可保持感染，经过冬眠后重新发生病毒血症。

2．沙粒病毒科

⑴胡宁（Juinin)病毒：胡宁病毒是阿根延出血热致病因子。属子沙料病毒的Tacaribe复合群。

豚鼠实验感染Junin病毒时产生类似人类阿根延出血热的致死性疾病。接种后5～8天，感染的动物开始发热，在11～15天体温过低，休克而死亡。病毒血症以及尿和唾液排出病毒一直到死。尸检时采集的主要器官中都有病毒。

乳鼠实验感染时产生典型的病毒性脑炎，死亡率为95～100%，成年小鼠有抵抗力。

⑵拉沙（Lassa)病毒：拉沙病毒属于沙粒病毒科。新生小白鼠脑内接种此病毒引起不显性持续感染。成年小鼠脑内接种后5-7天出现致死性疾病，有痉挛发作，最后后腿强直、呼吸停止。成年多乳鼠实验感染为隐性感染。松鼠猴肌肉接种后，经10-14天潜伏期，动物发生多变www.lindalemus.com/jianyan/的致死性疾病。豚鼠腹腔内接种后，发生呼吸功能不全，约67%的动物死亡。

⑶淋巴细胞脉络丛脑膜炎（LCM)病毒：本病毒与拉沙病毒，马秋堡（Machupo)病毒同属沙粒病毒属，对小白鼠脑内接种尤为敏感，可供分离病毒用，对猴及豚鼠有致病力。

应使用4周龄的小鼠及乳鼠、未断乳豚鼠200-400g重的豚鼠。可能时，采用“瑞士”Albinos种小鼠。饲养中，应确保无LCM病毒感染。为取得最好效果，一方面接种幼年动物，另一方面用年龄较长的。接种量如下：

6-8天龄乳鼠：脑内接种0.03ml，腹腔接种0.2ml。

4周龄小鼠：脑内接种0.03ml，腹腔接种0.25ml。

未断乳的小鼠：脑内接种0.05ml，腹腔接种1ml。

已断乳的200-400g豚鼠，脑内接种0.15ml，腹腔接种5ml。

不同接种途径的感受性亦是不同的。脑内接种感染而发病的鼠数（4周龄以上的)远比经腹腔内接种者为多。经腹腔接种者可不显任何症状。豚鼠（250g以上)二种接种途径的发病数大致相等（有进脑内接种稍高些)，但这些资料并不对所有毒株适用。

小白鼠感染后表现多变，可能有三种过程：⑴急性疾病并死亡；⑵急性急病，恢复并产生抗体；⑶形成持久的耐受性感染，携带病毒，不产生抗体。决定因素有：⑴感染的病毒株；⑵接种途径（最为重要)；⑶动物感染时的年龄。

产生急性疾病的动物一般在感染后4-7天出现体征。表现为：弓背、竖毛、嗜睡、眼睑炎、头部水肿等。

3．小RNA病毒科

⑴脊髓灰质炎病毒：脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸（RNA)病毒科、肠道病毒属的一种。1908年Landsteiner和Popper成功的把此病毒传播于猴。在后来的40年里证明了亚人类灵长类能经消化道感染，有些株能适应于实验室的啮齿类。

猴子：在此属内，猩猩能感染和人类完全相似的疾病。但此类动物不易常备。实际工作中，各种不同的猕猴对本病来说是猿类中最为优良的品种，特别是Macacus　Rhesus。长尾猴类以及狒狒类对脊髓灰质病毒亦有感受性，唯敏感性远较猕猴为差。接种方法很多，脑内注射未必是最佳的，可用：腹腔注射、坐骨神经附近的深部肌肉注射、鼻腔滴注。实验操作中最好以不同方法混合接种。

啮齿动物：病毒在应用啮齿动物前，常需经猿子适用1-2代。啮齿动物（棉鼠、小白鼠、田鼠、鼷鼠)可经脑内接种，最好选用年幼动物、2-3周龄的小白鼠或15天龄的棉鼠。动物常于12-25天出现麻痹。

⑵柯萨基（Coxsackie)病毒：柯萨基病毒属小RNA病毒科肠道病毒属。根据本病毒对乳鼠的致病情况将其分为两组：A组：产生弥漫性肌炎伴有随意肌纤维的急性炎症及坏死。B组：主要引起大脑局部退行性变等。

柯萨基病毒常用的传代和分离方法，是乳鼠脑内、腹腔内或皮下接种。4-5日龄的小鼠对A组病毒的感染仍然敏感。但B组病毒在1日龄或更小的小鼠繁殖最好。即使是成鼠，给予注射可的松、X线照射或感染期间持续暴露于寒冷（4℃，B组病毒)或严重营养不良都可使其对柯萨基病毒易感。通常乳鼠在症状出现后24小时内死亡。除乳鼠外亦可用3周龄以内的鼷鼠（Merion)，它有固定的感受性，可用以分离及传代。恒河猴脑内接种A₇和A₁₄病毒引起中枢神经系的神经节细胞广泛变性，进而导致松弛性麻痹。

4．布尼雅病毒科

肾综合症出血热病毒（HFRSV)属于布尼雅病毒科、布尼雅病毒属，其敏感动物详述于后。

5．正粘病毒科

流感病毒：属于正粘液病毒属。动物模型最好用雪貂，也可用小白鼠、金黄地鼠、豚鼠、猴及猪。

雪貂：是较为理想的交流感动物模型。白色皮毛的雪貂似较杂色雪貂为敏感。病理材料经鼻腔内接种。雪貂对甲、乙型流感均易感，病毒不经适应即能对雪貂致病，并易传播给其它雪貂和人。其临床表现与人相似，发热，并伴上呼吸道感染。愈后血清中产生高滴度抗体。

小白鼠：对流感病毒敏感。但其症状与人不同，主要表现为下呼吸道感染，并死于肺炎。直接取自患者的材料不宜于小白鼠分离病毒。适用的方法是：有毒材料应①在乙醚麻醉下通过鼻腔接种，②先在雪貂身上适应。

金黄地鼠：地鼠对研究流感温度敏感变异株很有用处。地鼠为隐性感染，但可在鼻、肺部测出病毒繁殖量。有利之处是：其体温和鼻部温度与人的相似。对人毒不同的流感病毒温度变异株，在地鼠机体也表现出相似的差异。

6．副粘病毒科

⑴麻疹病毒：除灵长类外，一般动物均不易感。1911年首次成功地传给猕猴。以后证明，除了接触和吸入外，其它种类的猴，如：猿类、恒河猴、崇猴、爪哇猴、倭猴等，对各种不同接种途径也易感。其症状类似人类麻疹。潜伏期为3-22天，病毒血症期为4-15天，约一半动物有皮疹、结膜炎、卡它和发热。

适应在组织培养上的病毒可在乳腺或乳地鼠体内繁殖，脑内接种可引起脑膜炎症。

⑵呼吸道合胞病毒：猩猩感染后可产生与人一样的上呼吸道临床症状。

猴，Cebus猴感染本病毒后，可引起肺炎。在肺和支气管都可以找到呼吸道合胞病毒抗原。Cebus猴感染后4-6天，病毒繁殖方可达高峰，并出现临床症状。

雪貂年龄愈小，病毒繁殖量愈大。3日龄雪貂，鼻内感染时其肺部病毒量可达105PFV/g肺组织，7-14龄雪貂，肺病毒量仅103-104PFV/g肺组织；28日龄的雪貂，其肺内测不出病毒繁殖量。

此外，地鼠和棉鼠对呼吸道合胞病毒较敏感，感染后，在其细支气管及肺可以找到呼吸道合胞病毒。

7．弹状病毒科

狂犬病毒（Rabies　Virus)：1987年Galfiev　首先用家兔作为实验动物，进行了传统的实验，在该实验中，巴斯德培育了对犬致病力减弱而对家兔具有固定潜伏期的病毒。

为了建立实验室感染，常选用：中国地鼠、小白鼠、豚鼠和兔（按敏感性程度排列)。颅内接种比皮下或肌肉注射更可靠。

小白鼠的狂犬病毒伏期一般为8-14天，很少超过20天。表现为竖毛、弓背、活跃兴奋或淡漠无力，进而战栗，后肢瘫痪，死亡。

家兔：初始症状为瞳孔扩张，数小时后呼吸困难、瘫痪，潜伏期一般为12-25天。

豚鼠：潜伏期比家兔短，当发生症状后，常有兴奋期，此时，动物变得凶暴，最后瘫痪。

（二)常见DNA病毒的敏感动物

1．痘病毒科

天花病毒：猴及家兔均敏感。应选用雄兔作皮肤划痕接种、角膜划痕接种、睾丸内接种。猴子则在胁腹部皮肤上作划痕接种，如系雄猴则同时作睾丸内接种。感染后兔皮肤上出现明显的皮疹，局限于皮肤划痕处；角膜炎性轻微或缺如，无睾丸炎。猴沿皮肤划痕出现典型皮疹，如做睾丸内接种，则有睾丸炎发生。

2．疹病毒科

⑴单纯疱疹病毒（HSV)：家兔为最适宜的动物，豚鼠、小白鼠、地鼠亦可用。用家兔及豚鼠的原因之一，是因为可以用有菌材料做角膜接种而可不加抗菌素或过滤，不妨碍病毒生长。

家兔角膜途径接种：导致角膜结合膜炎。脑内途径接种：出现脑炎症状，最后死亡。

豚鼠角膜接种：病损如家兔。脑内接种：有发热，偶而有脑炎症状。

皮肤接种：最好在足蹠皮内作划痕，皮肤可出现皮疹，最后可能死亡。

小白鼠：最好用新生小鼠。经脑内或腹腔接种。动物呈脑炎症状，最后死亡。亦可同时接种一批“病毒－抗疱疹标准血清”混合液，以观察第一批动物死亡及第二批动物存活情况，以签定病毒。

⑵水痘一带状痘疹病毒（VZV)、巨细胞病毒：还未发现有实验动物对这两种病毒敏感。

（三)未分类病毒的敏感动物

1．www.lindalemus.com甲型肝为病毒（HAV)

1967年Deinhardt等首次证明HAV可在狨猴体内增殖，此后Mascoli等从狨猴体内发现人类HAVCR326株。

狨猴、黑猩猩、红面猴对HAV均易感，经口或静脉注射接种病毒后，可产生肝炎。

肝组织呈现肝炎的病理改变。细胞浆内查到HAV抗原，恢复期血清中检测出相应抗体，粪便中可排出HAV颗粒。

2．乙型肝炎病毒（HBV)

黑猩猩是HBV的易感动物。狨猴虽可感染但不如前者敏感。因此用黑猩猩研究HBV的发病机理、检测自动免疫、被动免疫的效果以及HBV疫苗的安全性。

目前为止，各种病毒敏感动物的研究。仍然是病毒学中引人瞩目的的领域，因为在不同病毒疾病发病机制的研究、抗病毒药物筛选、疫苗效果及安全性鉴定等方面，动物模型都有其独特的优越性。但就病毒分离而方，使用组织培养的方法，对于某些病毒更为方便。不同实验室可根据其实验目的、动物来源情况等，选择不同的敏感动物。

三、HFRS动物模型的研究和应用

肾综合征出血热病毒（HFRSV)，属布尼亚病毒科（Bungavividae)中的一个新属，称为汉坦病毒属。自1978年南朝鲜李镐汪首次以疫区黑线姬鼠肺分离到HFRSV（亦称汉坦病毒Hantaan　Virus,HTNV)后，对其动物模型进行了众多的研究。

（一)HFRS感染动物模型

感染动物模型的亚临床感染，亦无明显病理变化，主要用于病毒分离和传代。目前有：非疫区黑线姬鼠、大白鼠、长爪沙鼠、家兔等。

1．黑线姬鼠

非疫区黑线姬鼠是最早用于病毒分离和实验研究的动物。据报道用各种途径（肌肉、皮下、肺内、鼻内、或经口)接种均可使黑线姬鼠感染。皮下和肺内接种0.1ml汉坦病毒或待检其其它材料后，10天左右肺部出现病毒，以后在肾、肝、颌下腺中可检出病毒。约接种后20天，肺中病毒滴度最高，以后逐渐下降，但150天后仍可检出。

黑线姬鼠为野生鼠类，常有野生啮齿类病毒的污染，加之来源、人工饲养、繁殖等问题较难解决，因而使用受到一定限制。

2．大鼠成鼠

1981年Leepw等将朝鲜出血热病毒接种到雌性、1月龄Wistar和Fisher大鼠。这是首次将该病毒接种于实验大鼠，肌肉接种0.5ml汉坦病毒后14-65天，肺内可发现其特异性抗原；接种后三周，血清中可检出特异性抗体，除脾脏亦可查到特异抗原外，与黑线姬鼠脏器的抗原分布相同。

朝鲜出血热病毒对实验室大鼠的适应，提供了无野生啮齿类病毒污染的实验模型。现已应用于特异性药物治疗研究。

3．长爪沙鼠成鼠

1983年朱智勇等发现长爪沙鼠对HFRSV敏感。六种途径（肺内、皮下、腹腔、口腔、肌肉)接种，第1代即可感染，无需传代适应；脏器内检出特异性荧光部位与黑线姬鼠相同。接种病毒后4天，肺组织中查见病毒抗原，5-7天过高峰，通常于10-14天消失。接种后8天，查到抗体，14天达高峰。长爪沙鼠可用多种宿主动物体内HFRSV的分离，且在较短时间内即可获得毒株。而且，这些毒株可用于疫苗的研制。

4．家兔

HFRSV感染的家兔，与长爪沙鼠成鼠一样，亦为无症状短期自限性隐性感染。不同来源的HFRSV，除口饲外，肌肉、腹腔、肺内、皮下接种均可使家兔感染，并能在体内连续稳定地传代，但不表现任何症状。接种后4天，有持续数天的病毒血症，7-14天可在多种器官内找到病毒抗原，以脾、小肠、胰腺中为明显，肺、肝、肾等组织内偶尔可见，8-9天抗原量最多，同时在血液中开始查到相应抗体，随抗体效价增长体内病毒抗原很快减弱，至第15天完全消失。

初步实验表明，R3和76/118株都能使乳兔感染，其表现与成兔相似，全身多种脏器组织内可检出病毒抗原，但其荧光亮度更强，提示乳兔对HFRSV更敏感。

（二)HFRS致病动物模型

致病动物模型为显性感性甚至死亡，并伴有明显病理改变。主要用于发病机理研究、药物筛选等。目前有小白鼠乳鼠、大鼠乳鼠、裸鼠及环磷酰胺处理的金黄地鼠。

1．小鼠乳鼠

Tasi等报道了第一个致病动物模型，即新生小白鼠（2-4龄)。相继发现CD-1、ICR、Balb/等品系乳鼠均对HFRSV敏感。颅内、腹腔、肌肉、皮下接种均可使其感染。我们的研究发现：颅内、腹腔联合接种与单纯颅内接种，在发病时间、抗原分布上无明显差别。但腹腔接种乳鼠发病时间要比脑腹联合接种及单纯脑内接种平均迟4-5天。病毒抗原广泛分布各脏器（脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺)，脑内接种0.02ml经乳鼠传代适应的汉坦病毒76/118株（LD50、10-6·5/0.02ml)，乳鼠第7天开始发病，表现为蜷缩、活动减少、耸毛、弓背、尾强直、后肢麻痹，直致死亡，发病规律。

乳鼠现已成功地用于病毒分离、繁殖高滴度HFRSV，并被用于研究不同来源毒株的毒力及测定疫苗效力和安全性、筛选抗病毒药物及研究发病原理。

2．大鼠乳鼠

Fishet大鼠（E344/N)出生后24小时内，分别颅内接种HFRSV76/118株和B-1株（分离自实验室大鼠)，死亡率分别为18.8%、42.9％。腹腔分别接种上述两种毒株，观察至第50天，仍未见死亡。

3．金黄地鼠

每只地鼠腹腔一次注射200mg/kg环磷酰胺，48小时后，腹腔或皮下注射病毒悬液1ml，或脑内接种0.05ml。绝大多数动物在感染后7-9天病死。在病死地鼠的各器官均发现有HFRS病毒抗原，并分离到病毒。各器官的病理变化酷似人体出血热病变。

4．裸鼠

14-42天龄的CK-1无胸腺裸鼠，脑内接种104·4PFU（0.02ml)汉坦病毒76/118株后40天，表现有体重减轻、活动减少、站立不稳、嗜睡等，最后全部死亡。而其同龄同窝兔功能正常鼠不发病。

我们用乳鼠适应的汉坦病毒76/118株感染了21日龄NIH品系的无胸腺裸鼠，感染剂量2.5×10⁵LD₅₀，（脑腹联合接种，0.02ml/脑，0.05ml/腹)。最早于第8天开始发病，表现为活动减少、互相抱团、食欲减退、体重减少、弓背、后肢麻痹，于20天内全部死亡。而接种相同量病毒的同窝免疫功能正常鼠则不发病。脑、心、肝、脾、肺、肾均有特异抗原，脑内抗原荧光最亮。初步观察了人白细胞干扰素对裸鼠感染的保护作用，剂量为：20×10⁶μ/kg，腹腔内给药，自病毒感染当天开始，连续用药6天，发现治疗组比对照组存活时间延长1.5-3天，进一步的研究正在进行中。

（三)灵长类和树鼩

灵长类的研究尚无肯定的结果。

非洲绿猴、脑内接种HFRSV后，观察7周，未见临床症状及病理变化。Amyx等发现猕猴和黑猩猩接种后，可有规律地出现短暂蛋白尿、病毒血症，偶见痰质血症。在日本，用HFRS病毒接种幼龄猕猴（Ｃynomolgus)后７周，可见有与HFRS病人相似的病理变化：肾、肺、脾、心脏和肝可见毛细血管扩张、部分脏器可见弥漫性血管内凝血（DIC)、肾髓质集合管退行性变、感染3-4周有蛋白尿，并在组织中检出抗原，但未观察到临床症状。看来猕猴可能有希望做为较好的致病研究模型。

国内未志勇等将R₃株病毒接种三只恒河猴（3～4岁)，研究HFRS病毒在猴体内的分布、增殖和排出，研究结果表明，接种病毒后3～5天即出现病毒血症，直至血液中检出抗体前2天止，持续8天之久；猴产生抗HFRS抗体时间在接种后第14天，且IgG和IgM抗体同时出现；病毒血症期直至产生抗体上，猴体内各器官组织未发现病毒增殖。此时粪便和尿都未分离出HFRS病毒。从而可推测HFRS病毒在猴体内增殖的部位可能是循环血细胞内，这与近年来证明该病毒在病人血细胞内增殖相符。

最近严玉辰等将A16株病毒接种于六只树鼩，每只由皮下和脑内混合接种10^-1病毒悬液1ml。结果：1～2号树鼩于接种后7天死亡，经检测脏器抗原皆阴性，死后查血清抗体阳性。3～6号树鼩接种病毒后，经2～4次尿抗体检查均阴性，血清抗体皆阳性。接种病毒7天后，均有不同程度的体温增高现象。其中5号树鼩于接种病毒在9天死亡。抗原在树鼩脏器组织中的分布颇为广泛，但1～2号小兽血中有抗体，脏器内未检出抗原，何种原因尚待研究。初步看来此种小兽对HFRS病毒较敏感，但非理想的敏感动物。其不同年龄、不同毒株、不同剂量的实验，有待进一步深入研究。（本节常见病毒敏感动物的选择资料由王晶翼同志提供)。