网站首页
开云app安装不了怎么办
药师
护士
卫生资格
高级职称
住院医师
畜牧兽医
医学考研
医学论文
医学会议
开云app安装
网校
论坛
招聘
最新更新
网站地图
中医理论中医临床诊治中医药术语标准中国方剂数据库中医疾病数据库OCT说明书不良反应中草药图谱药物数据药学下载
您现在的位置: 医学全在线 > 中医理论 > 中医书籍 > 正文:冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程
    

中国生物制品规程:冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程

本品系用从健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因重组质粒,转染大肠杆菌,使之高效表达人α1b干扰素,经高度纯化后冻干制成。用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病等疾病。1 菌种1.1菌种来源系带有人α1b干扰素基因的pBVXα1b质粒转化的大肠杆菌JM103株。投产的…

本品系用从健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因重组质粒,转染大肠杆菌,使之高效表达人α1b干扰素,经高度纯化后冻干制成。用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病等疾病。

1 菌种

1.1菌种来源

系带有人α1b干扰素基因的pBVXα1b质粒转化的大肠杆菌JM103株。投产的工程菌需经卫生部批准。

1.2菌种特性

菌种表达稳定,表达水平符合投产菌种要求。

1.3制造用菌种库的建立

从原始菌种库传出,经扩大后冻干保存,或由上一代制造用菌种库传出,扩大后冻干保存作为制造用菌种库,但每次只限传三代。每批制造用菌种库均应进行下列检定,合格后方可投产。

1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态,无其他杂菌生长。

1.3.2涂片革兰氏染色

在光学显微镜下观察应为典型的革兰氏阴性杆菌。

1www.lindalemus.com/pharm/.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌种相符。

1.3.4电镜检查

应为典型大肠杆菌形态,排除支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

1.3.6干扰素表达量

在摇床中培养,应符合原始菌种的表达量。

1.3.7表达的干扰素型别

应用标准抗α型干扰素血清作中和试验,证明型别无误。

1.3.8质粒检查

应做该质粒的酶切图谱,应与原始质粒相符。

1.4种子液制备

1.4.1菌种传代用LB培养基

液体LB培养基不含琼脂,供摇床培养用,含2%琼脂供制备平板和斜面用,含0.5%琼脂的半固体供短期保存菌种用。

1.4.2生产菌种的制备和检定

取制造用菌种库冻干菌种,开启后划种培养基平板2~3块,培养后挑取平板中典型集落8~10个,分别培养后保存,然后分别进行干扰素表达量测定,至少重复一次,先其中干扰素表达量最高的一份供生产制备种子液用,其表达量应符合原始菌种库的表达量,所表达的干扰素应用标准抗α型干扰素血清作中和试验,证明型别无误。

1.4.3种子液的制备

将菌种接种M9CA培养基,在摇床中培养至OD值在0.4~0.8之间即可供发酵罐接种用。种子液应进行质粒稳定性检查。

2 发酵

2.1每次发酵前必须进行一次空罐灭菌。

2.2发酵用GMD培养基,用蒸馏水配制,其中不含有任何抗生素,配制后进行实罐灭菌。

2.3发酵温度为36.5±0.1℃,根据工程菌生长情况到后期可适当调整温度,并作必要的培养基成分添加,发酵时间根据工程菌生长情况确定。发酵结束时放出菌液,发酵灌应再进行一次灭菌并清洗。

3 收菌

用离心法收取菌体,称重,容器上标明批号、罐别、重量、日期。收获的菌体如在24小时内破菌裂解可保存于4~8℃冷库,否则应置?/FONT>30℃冻存。

4 菌体裂解与粗制干扰素制备

用高压匀浆法裂解菌体,将菌体作成10%~20%的悬液进行高压匀浆,压力50Mpa/cm2,连续匀浆二次,匀浆后的悬液离心后取上清即为粗制干扰素。

5 浓缩与纯化

5.1初步纯化

采用不同原理多步骤的方法,使初步纯化的干扰素达到外观无色透明,无絮状物,比活性在105IU/mg蛋白以上,并将其浓缩至原体积的1/10~1/20,保存于4℃,如3天内不能进行高度纯化,应冻存于?/FONT>30℃冰箱内。

5.2高度纯化

经初步纯化后进行高度纯化,去除绝大部分非干扰素蛋白,使其达到本规程7~8项要求。高度纯化应在洁净度为10000级的恒温(15~18℃)室内进行。

5.3在高度纯化过程中应进一步浓缩,使体积为初步纯化干扰素的1/5~1/10。并应转换缓冲液系统,使之适合于人体注射用。

5.4在整个浓缩与纯化过程中不得加入对人体有害的物质。

5.5在浓缩纯化过程中应特别注意去除热原质,用于分子筛层析的溶液,配合后应进行去除热原质处理。容器应干热灭菌,不能干热灭菌者应用适当浓度的NaOH处理。

5.6浓缩纯化最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”,取样进行7.1~7.4项检定后,立即加入人白蛋白,使其最终含量为2%,称为“加白蛋白半成品”,取样测定干扰素效价,其余冻存于-30℃冰箱中,应尽量避免冻融。

5.7所用的人白蛋白应符合相应规程要求,HBsAg。

6 稀释、除菌过滤

6.1将检定合格的加白蛋白半成品以乳径为0.22μm的滤膜除菌过滤,除菌后立即进行稀释。

6.2稀释液制备

用合格的蒸馏配制生理盐水,经高压灭菌,加入检定合格的注射用人白蛋白,使最终含量为2%,即为稀释液。配制后应立即用于稀释。

6.3稀释

除菌后加白蛋白半成品用稀释液稀释至所需浓度。稀释后用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌,保存于4℃,并取样作无菌试验和热原试验,合格后进行冻干。

7 半成品检定

每批半成品抽样进行7.1~7.7项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行7.8~7.12项检定。

7.1效价测定

用细胞病变抑制法,Wish细胞/VSV为检测系统。用国家参考品校准为IU。

7.2蛋白含量

用Lowry法测定。同批不同阶段的样品比较时应尽可能同时测定。

7.3比活性

根据效价测定及蛋白含量计算比活性,本品的比活性应在107IU/mg蛋白以上。

7.4纯度

7.4.1电泳纯度

用非还原型SDS?/FONT>PAGE法,加样量不低于5μg,经扫描仪扫描,纯度应在95%以上,聚合体不得超过10%。

7.4.2高效液相色谱纯度

用280nm检测,应呈一个吸收峰,或主峰占总面积95%以上。

7.5分子量测定

用还原型SDS?/FONT>PAGE法。加样量不低于5μg。制品的分子量与理论值比较,误差不超过10%。

7.6残余外源性DNA含量

用固相斑点杂效法,以地高辛标记的核酸探针法测定,其含量应少于100pg/剂量。

7.7残余IgG含量

如采用单克隆抗体亲和层析法纯化,应进行本项检定。采用ELISA双抗体夹心法测定,IgG含量应少于100ng/剂量。

7.8残余工程菌蛋白含量

用酶标法或其他敏感方法测定,残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%.

7.9抗生素活性

半成品中不应有残余氨苄青霉素活性。

7.10肽图测定

应符合α1干扰素的图形,批与批之间图形应一致。

7.11等电聚集

测定等电点,应有固定的范围(4.0~6.5之间)。

7.12紫外光谱扫描

检查半成品的光谱吸收值,批与批之间应一致,应有固定的最大吸收值。

8 除菌半成品检定

8.1效价测定

同7.1项。

8.2无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

8.3热原质试验

按《生物制品热原质试验规程》进行。每只家静脉注射干扰素5万,判定标准按该规程4.1项要求进行。

9 成品检定

9.1处观

应为微黄色薄壳状疏松体,加入1ml蒸馏水后溶解迅速,不得含有肉眼可见的不溶物。

9.2 pH值

pH值应为6.5~7.5。

9.3无菌试验

同8.2项。每批抽样不少于10支。

9.4水分

应≤3%。

9.5热原质试验

同8.3项。

9.6价测定

同7.1项。效价应为标示量的80%~150%。

9.7安全试验

9.7.1豚鼠试验

用体重300~400g豚鼠2只,每只腹侧皮下注www.lindalemus.com/zhicheng/射1ml(于1ml生理盐水内),观察7天,豚鼠应健存,每只体重增加判为合格。

9.7.2小白鼠试验

用体重18~20g小白鼠5只,每只腹腔注射0.5ml(于0.5ml生理盐水内),观察7天,动物应健存,每只体重增加判为合格。

10规格

10μg/瓶,20μg/瓶和30μg/瓶。

11保存与效期

保存于2~8℃,自效价检定合格之日起效期为2年6个月。

...
关于我们 - 联系我们 -版权申明 -诚聘英才 - 网站地图 - 医学论坛 - 医学博客 - 网络课程 - 帮助
医学全在线 版权所有© CopyRight 2006-2046,
皖ICP备06007007号
百度大联盟认证绿色会员可信网站 中网验证
Baidu
map