中国幽门螺杆菌研究:抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备和临床应用

Marshall等于1983年首次从胃粘膜组织中分离到幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp)，并报道和B型胃炎及消化性溃疡密切相关。目前鉴定和诊断Hp感染有许多方法，但受种种因素制约，但结果受到一定影响。目前制备抗Hp单克隆抗体（Hp－mAb)的资料不多，Hp－mAb免疫过氧化物酶染色检测胃粘膜活检标本，国内未见报道。我们成功地制备了Hp－mAb，对其特性进行了一系列鉴定，并应用于临床检测，现报告如下。

1　材料和方法

1.1　Hp－mAb的制备

Hp109菌株系上海二医大微生物教研室生慢性胃炎病人分离而得，经系经生物学状鉴定。细菌微需氧培养后用生理盐水洗下菌苔，洗涤3次，56℃30min灭活，1×10⁸CFU/ml浓度0.5ml，免疫Balb/c小鼠.每隔10d以同样浓度剂量增强免疫，共2次。末次免疫后10d断尾取血，www.lindalemus.com/zhuyuan/用酶联免疫吸附试验（ELISA)测定抗体效价。其效价大于1：1024，再以1×10⁸CFU/ml浓度0.5ml，加强免疫一次。第三天后取致敏Balb/c小鼠细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞用PEG作融合。经ELISA筛选后，选择分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞，以有限稀释法作克隆共4次。取杂交瘤细胞腹腔注入Balb/c小鼠，2周后收集腹水，离心（1500g)10min，去除细胞沉淀及脂肪，其腹水为Hp－mAb。ELISA筛选，Hp109超声粉碎抗原2.5μg/μl包板；加50μl克隆细胞上清液，再加辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG（1：1000稀释)，于酶标仪490nm处读取吸光度值。

1.2　Hp－mAb特性鉴定

抗体类别及亚类鉴定无血清杂交瘤细胞培养上清液与抗小鼠各类免疫球蛋白及其亚类IgA，IgM，IgG1，IgG2，IgG3，IgG2a，IgG2b（Miles LabInc，USA)作免疫双扩散试验。①聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE)：Hp109，Hp152，H99，Hp82，空肠弯曲菌（CJ)3276，结肠弯曲菌（CC)3276超声粉碎抗原，稀释至2mg/ml。加样15ul；分离胶浓度10％；15mA恒流；以低分子量标准蛋白（17500－94000)作标准，考马氏亮监R25染色。②免疫印迹法：Hp109超声粉碎抗原，经SDS－PAGE后电转移至混合纤维滤膜上，电流450mA，7h，洗涤后加Hp－mAb腹水（1：50稀释)室温振荡过夜。洗涤后加辣根过氧化酶标记兔抗鼠IgG（1：200稀释)，室温振荡2h。洗涤后用二氨基联苯胺（DAB)显色。蒸馏水冲洗终止反应。

1.3　敏感性鉴定

取18株常规鉴定为Hp菌株，细菌悬液涂片，丙酮固定60min后加Hp－mAbSCH9（1：100稀释)，过夜。洗涤后加辣根过氧化酶标记兔抗鼠IgG（1：250稀释)，室温1h，洗涤后二氨基联苯显色。蒸馏水冲洗终止反应。结果判断：（－)Hp未染色；（＋)Hp淡棕色；（++)Hp深棕色；（+++)Hp棕黑色。以（++)以上为阳性。

1.4　特异性鉴定

选择15种常见肠道标准菌株作免疫过氧化物酶染色，方法同前，所用菌种如下。CJ3276和CC3278由法国Bordeaux儿童医院Megraud博士惠赠。鼠伤寒沙门菌50013，伤寒沙门菌50097，福氏志贺菌51574，产气肠杆菌45102，小肠结肠耶尔森菌Y106，副溶血性弧菌20549，蜂窝哈夫尼亚菌45201，粪碱杆菌40001，司徒氏普罗威登斯菌420020，普通变形杆菌49102，弗劳地枸橼酸杆菌48107，粘质沙雷氏菌41002，大肠杆菌69－84由上海卫生防疫站提供。

1.5　Hp－mAb初步应用

从Hp阳生治疗后复查病人胃窦部取2块胃粘膜活检标本，同时做培养，涂片Gram染色和Hp－mAbSCH9免疫过氧化物酶染色。

2　结果

2.1　杂交瘤细胞株建立

本实验细胞融合率为66.7％（193/288)，其中分泌抗体孔率为37.5％（72/192)，经筛选获得3株Hp－mAb杂交瘤细胞株（SCH7，SCH9和SCH10)，接种小鼠腹腔后获得腹水效价，列于表1。

表1　三株Hp－mAb性质类别

2.2　Hp－mAb特性鉴定

①抗体类别及亚类鉴定结果见表1。②与Hp－mAb相应的Hp抗原分子量的鉴定结果：Hp不同株之间菌体蛋白条带相似，其7条主要菌体蛋白为71000，62000，58000，52000，29000，22000，12000。CJ和CC菌体蛋白相似，与Hp明显不同，缺乏5800条带。免疫印迹法3Hp－mAb均与Hp菌体蛋白58000条带反应。

2.3　敏感性鉴定结果

Hp－mAb SCH9与18株Hp菌株反应均阳性。Hp被染成深棕色或棕黑色，染色反应均强于（++)，染色程度无明显差异。

2.4　特异性鉴定

Hp－mAb SCH9与15株常见肠道标准菌株反应均阴性，未出现（＋)以上的染色反应。

2.5　Hp－mAb初步应用

Hp－mAb SCH9免疫过氧化物酶染色检测胃粘膜活检标本，结果列于表2。Hp被特异染成深棕色。Hp－mAb阳生率高于培养和/或涂片Gram染色，两种检测方法差异有显著性（P＜0.05)。

表2　不同方法检测Hp比较

3　讨论

有关Hp－mAb，目前国内外报道不多。制备Hp－mAb时，所用的免疫小鼠抗原有整菌抗原、超声粉碎抗原或酸提取抗原。我们采用Hp整菌免疫Balb/c小鼠，细胞融合后经筛选，得到3株高效价分泌Hp－mAb杂交瘤细胞株。

由于用Hp粗制抗原免疫小鼠，故各学者得到的Hp－mAb与Hp菌体蛋白反应的条带有差异。Engstrand等报道Hp－mAb与Hp25000菌体蛋白反应。我们用SDS－PAGE分析Hp，发现其不同株之间菌体蛋白相似，有7条主要蛋白条带。免疫印迹法发现3株Hp－mAb主要与其中5800菌株蛋白反应，与杉山敏郎报道一致，而CJ和CC菌体蛋白中不存在这一条带。困此可认为Hp58000菌体蛋白有较强免疫原性和特异性。我们制备的Hp－mAb SCH9与18株Hp反应阳性，与CJ和CC及其它常见肠道标准菌株反应阴性。结果表明敏感性好，特异性高，可以作为临床诊断或鉴定细菌用试剂。Hp－mAb免疫过氧化物酶染色操作简单，光镜可观察。与常规分离培养和/或涂片G染色比较，后者阳性标本前者全部阳性，另有7例分离培养和或涂片Gram染色阴性标本，Hp－mAb免疫过氧化物酸染色发现有少量Hp。结查表明两种检测方法差异有显著性（P＜0.05)。这种差异可能是由于Hp－mAb免疫过氧过物酶染色法Hp被特异地染成深棕色或棕黑色，背景淡，对比度好易于观察。因此，分离培养法与活检标本涂片Gram染色法实际检出效果可能还不及单纯用Hp－mAb免疫过氧化物酶染色法。