中国幽门螺杆菌研究:幽门螺杆菌在双相培养基中生长的特性

幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori, Hp)的发现被认为在人类胃炎病原学中具有重要的作用，此菌1982年首次发现，由Marshall等所描述并命名为Campylobacter Pyloridis，后来根据国际细菌命名规则（ICNB)改正为C.Pylori。1989年Goodwin等建议把Hp从弯曲菌属划出来，而成立一个新的属，称为幽门螺杆菌（HelicobacterPylori, Hp)，目前已在国际性刊物和国际会议上应用此名称。幽门螺杆菌为微需氧菌，地氧较敏感，此菌营养要求高，在普遍蛋白胨水或肉汤中不能生长，在固体培养基上Goodwin（1985)推荐以脑一心浸液琼脂为基础，加入7%马血清，1%Isovitalix(BBL)，万古霉素2mg/L，萘啶酮酸20mg/L，两性霉素2mg/L。该菌最适宜生长温度37°C，42°C条件下则不能生长，37°C下培养，细菌生长缓慢，培养3d～4d后在微氧条件下，固体培养基上可0.5mm～1mm直径灰白色透明的菌落，在血平皿上有时可见菌落周围有轻度溶血，该菌培养时要求温度高，尤其初代分离时，相对湿度至少要在98%以上，为此我们用布氏琼脂液体一固体双相培养基，对幽门螺杆菌的生长曲线进行了研究，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽门螺杆菌89404株自北京市积水潭医院球溃疡病患者的胃粘膜中分离；菌株鉴定结果：氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性。1%甘氨酸生长，马尿酸水解为阴性，37°C生长（+)，25°C生长为（－)。在3.5%NaCl中不生长，对庆大霉素、四环素、痢特灵等敏感，对万古霉素抗药，在布氏血琼脂上生长良好，有轻微溶血。

1.2 液体—固体双相培养基的制备取25cm3组织培养瓶，高压来菌后加入6%脱纤维羊血布氏琼脂20ml，平放，待凝固后，将瓶子垂直，再加入新鲜配制的布氏肉汤9ml，置4°C冰箱内保存备用。

1.3 生长曲线的测定 将全羊备注中加89404的菌株自-70°C冷冻保存的幽门螺杆菌融化，取0.2ml菌液接种在6%布氏血琼脂平思虑中，于5%O2，10%CO2，85%N2的混合气体条件下于37°C培养3d后观察，选取新培养的Hp89404用10%小牛血清布氏肉汤（pH7.2)洗下，作1:10稀释，每个尝试各换1支吸管，再经充分混匀后，取10^-4及10^-5两管进行活菌计数，然后取10^-4 菌液1ml(10.15×10²cfu/ml)，直接接种在液体—固体双相培养基中，此时按0h培养的菌数计算，即在双相布氏血琼脂培养中，每毫升含菌液浓度为1.02×10²/cfu/ml，然后将双相培养物置混合气体培养箱中，经不同时间（24h～144h)在布氏血琼脂平皿上进行活菌数测定。

1.4 pH值测定 将不同时间的菌株液取出，用精密pH试纸测定培养液的pH值，在测定前预备试验用数字式电pH样校正。

2 结果

2.1 幽门螺杆菌在固体培养基上生长特点

在固体布氏血琼脂平皿上，经37°C48hwww.lindalemus.com/zhuyuan/混合气体培养后，用10%小牛血清布氏汤洗下，菌液浓度掃标准比浊管18亿/ml菌配制，按10倍稀释法，取10-4管接种子固体布氏血琼脂上，经37°C72h培养后，菌落计数为1.02×10²cfu/ml，同样以10-4接种在双上培养基则为1.14×10⁴cfu/ml，而且在双相培养基上菌形弯曲较固体培养基上典型，球状菌体数量也较少。

2.2 Hp89404在双相培养基上的生长特点

为了解幽门螺杆菌生长特点，选择自胃病患者胃粘膜标本中分离的菌株（Hp89404)，采用布氏琼脂双相培养基进行培养，于不同时间各取培养物进行活菌计数，同时还进行pH值测定，实验结果见表1。

表1 幽门螺杆菌（89404)在布氏血双相培养基上生长

从附表可见，幽门螺杆菌经培养0～24h，上潜伏期到缓慢生长期，在血双相培养基中，于37°C培养12h～20h开始出现浑浊，24h～48h以后，即可出现迅速对数生长期，并持续到120h，达到生长高峰，此时菌落数最高达2.87×10⁵cfu/ml，以后随着培养时间的延长，菌落单位形成数则渐次下降，在144h时菌数为9.75104cfu/ml。从显微镜下观察菌体形态，培养24h～48h,见菌形呈较为典型的弯曲形、螺杆状或海鸥展翅样，到72h～96h为多形态性，有球状菌形出现。从液相培养液pH测定中24h～144h表明pH上原来7.2下降到6.4～6.9。

3 讨论

幽门螺杆菌的生长营养条件要求较高，胃粘膜培养物在固体培养基布氏血琼脂条件下，经37°C24h～48h微氧培养，细菌生长缓慢，在固体培养基上可见成睛集落细小 的灰白色透明的菌苔，初代培养经镜检形态为典型海鸥展翅样或S形弯曲菌，但经继代培养，特别是72h以后的培养物菌体常可变成多形态性，微球形则尤为多见，用双相培养物菌液均匀混浊，菌生长较快，保存时间相对也较长，这是否由于液体—固体双www.lindalemus.com/shouyi/相培养基，其营养及温度均有利幽门螺杆菌的存活，有待进一步研究。