|
关键词： 人类腺病毒；遗传性疾病；基因疗法
一群分布广泛的呼吸道病毒，A:60～90nM，无包膜，20面体立体对称型。分为大约47个血清群，其中Ad2、Ad4、Ad5和Ad7在疫苗和基因转移载体研究方面，应用最普遍。腺病毒粒子衣由252个壳粒组成，几何排列成240个非顶角六邻体和12个五邻体。基因组为双股DNA，呈线性，长度大约36kb。腺病毒的转录区分早期（early,E1、E2、E3、E4）转录区和晚期（late）转录区。复制周期大约为32～36小时。
腺病毒载体法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一。其生物学特性得到广泛研究。Ad有一个中等大小的基因组（平均36kb），适合于容纳于大片段基因，与反转发病毒载体相比，腺病毒载体能有效地外源基因转动到各种靶细胞或组织中。载体容易构建和操作。宿主范围广，感染性强，可经不同途径进入不同组织，能感染分化后的非分裂期细胞。在Ad生活周期中，其基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，外源基因能游离地表达。Ad制成疫苗临床应用表明，体内基因转移是安全是。
最近几年，Ad载体已引起科研人员的广泛关注，Ad可用于遗传病、传染病和肿瘤等疾病基因治疗的研究和应用。
一、不同动物组织中腺病毒介导的基因转移
Rosenfeld等[1]把α1抗胰蛋白酶（α1-An-titrypsin,α1-AT）基因转动到肺上皮细胞中，证实重组腺病毒载体和其野生型病毒一样，易感染宿主上皮组织，特别是呼吸道上皮组织。但把Ad载体通过静脉注射到小鼠模型体内，也可在肝内检测到大量载体。科研人员在不同动物模型上作了大量基因转移试验，证实采用气管内皮滴注法，肌肉注射、脑门实体接种等方法可感染Ad，感染部位有呼吸道内皮组织，肝组织、眼组织、羊膜内腔等。研究证明，重组Ad载体把目的基因转动到不同组织中，为Ad载体介导的遗传病基因缺陷纠正治疗提供了理论基础。
二、腺病毒介导的α1抗胰蛋白酶基因转移
大量临床病例表明，α1抗胰蛋白酶（α1-AT）缺陷症是高加索人肺部最普遍的致死遗传性疾病之一。Rosenfeld等[1]构建了含Ad主要晚期启动子（MLP）和重组人α1-AT基因的复制缺陷型Ad载体（Ad-α1AT），体内外分别感染棉鼠呼吸道上皮细胞。Lemarchand等[2]将Ad-α1-AT通过气管内滴注给小鼠后，在呼吸道上皮内可检测到人α1－AT mRNA，说明在肺组织内可合成并贮存人α1-AT。在鼠的呼吸道粘液中也可检测到人α1-AT（1.7μM），但会逐渐减少，一周后完全检测不到。通过静脉灌注，24小时后，可检测到平均13μg/ml的α1-AT，证实了重组Ad载体介导的体内内皮细胞基因转移的可能性。最近，Kochanek等[3]利用缺失了整个病毒编码基因的Ad载体，鼠尾静脉注转移19kb的人α1-AT基因组，发现13周内在鼠血清中可检测到大约1μg/ml的α1-AT。
三、腺病毒介导的低密度脂蛋白受体基因转移
家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolaemia,FH）是由低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,LDL）受体缺乏导致而成，与高胆固醇和早期冠状动脉疾病有关。最初在细胞培养中证实了Ad载体介导的LDL受体基因转移，注射过载体的小鼠血浆中胆固醇水平明显减少。据LDL受体的免疫荧光和β-半乳糖苷酶染色等实验检测，大约90%的肝细胞表达了Ad转移的基因。Kozarsky等[4]在转导的FH肝细胞中，Ad.CBhLDLR诱导的LDL受体蛋白至少比骨源性的要高20倍，将该载体注入一种叫新西兰白兔（NZW）中，发现NZW兔血清中胆固醇明显减少。Kobayashik等[5]构建极低密度脂蛋白（VLDL）受本的Ad载体的相关研究也已开始。他们用3×1019PFU的Ad mVLDLR静脉注射LDLR（-/-）小鼠，结果表明，感染后4～9天，小鼠体内总胆固醇水平减少50%。Ad载体介导的LDL和VLDL受体基因转移方法是一种治疗LDL或VLDL受体缺乏的有效方法，不足之处在于基因的表达量需加强。
四、腺病毒介导的囊性纤维变性转导调节因子（CFTR）基因转移
Ad载体介导的囊性纤维变性（cystic fibrosis,CF）基因治疗是Ad载体体内基因治疗最早的例子。一些科学家做了大量的工作，先后克隆了CFTR基因，构建了E1区缺失的Ad cFTR载体，在CF小鼠、棉鼠、非人灵长类动物，人呼吸道上皮细胞中，完成了该载体的安全性、毒性和生物学效应的研究。
尽管CFTR的基因转移率较低，但在感染细胞中，CFTR的基因表达要体内外都能被检测出来。动物模型研究和临床试验表明，CFTR基因表达是短暂是，并且随着宿主细胞免疫反应的发展而终结。这促使人们改进缺失E1区的Ad载体，试图发展既缺失E2A区，又缺失部分E4区的新一代载体。最近，Fisher[6]等开始研究缺失所有病毒编码序列的Ad载体，并且开始应用该载体把CFTR表达盒转移到人气管上皮细胞内。
五、腺病毒介导的杜氏肌肉营养不良症（DMD）基因转移
DMD是由于功能性营养蛋白缺乏而引起的致死性遗传病。DMD的基因治疗就是通过质粒表达载体和重组病毒（如逆转录病毒和腺病毒等）载体，将功能性营养蛋白的cDNA导入肌肉细胞内。Hauser等[7]在转基因mdx小鼠中，分别转移6.3kb的一段基因和cDNA全基因，证实可以部分或全部纠正小鼠的病理症状，小鼠的肌肉力量可以恢复。1993年，Vincent等[8]最早通过缺失E1区Ad载体的介导，将微小基因转移到新生的小鼠肌肉中，观察到DMD症状明显减弱。1996年，Acsadi等在利用mdx小鼠进行的腺病毒介导的营养不良微小的基因转移中也证实了这一点。最近，Kochanek等[10]利用一种微小腺病毒载体，把全长DMD cDNA转运到mdx小鼠的肌肉中也取得了很好的效果。
六、腺病毒介导的Ⅸ因子基因转移
血友病B（haemophilia B）是一种血液凝血因子IX（F IX）缺乏综合症。现已通过不同的基因转移方法在体内，外作了大量的基因转移实验。在动物模型中，把F iX基因转移到成纤维细胞、内皮细胞、成肌细胞和角质形成细胞中，但表达水平较低。
利用Ad体内基因治疗血友病B正在取代逆转录病毒介导的方法。Smithtag等[11]通过AvIH9B载体把呼吸道合胞病毒（RSV）启动子启动的F iX cDNA表达盒注射小鼠尾静脉中，结果可在肝得到有将效转导，9周后，其表达水平才会慢慢减弱。Dai等[12]用Ad载体把带有巨细胞病毒（CMV）增强启动子的FIX表达盒肌肉注射到裸鼠体内，血浆中可得到人F iX的高水平表达（1～5μg/ml），持续时间1年。如果载体在小鼠骨有某种免疫活性，血浆F iX的表达时间会缩短，表达量会降低，在血友病犬模型中也证实了这些结果。
七、腺病毒介导的Ⅷ因子基因转移
血友病A（haemophilia A）是由Ⅷ因子正常或缺陷引起的，主要表面为不自主的出血并发症。早期，采用细胞移植、反转录病毒载体等方法在动物模型中仅能得到FⅧ低水平表达和分泌。现在采用缺失E1区的Ad载体，转运B区缺失的FⅧ（BOD fⅧ）的cDNA，感染1周后，在HepG2细胞系和C57BL/6小鼠中，FⅧ得到了30793ng/ml的高水平表达。
AvlALApH81是一种小鼠白蛋白启动子，由AvlALH91载体带有一个Apo-A1内含子和一个HNF3/eG-Tf连接位点改建而成。Connelly等[13]把该载体注射到小鼠体内后，能显著增加血浆中BOD-FⅧ含量，可达到1046 163ng/ml。BOD-FⅧ主要在肝中表达，其分泌时间可维持4周左右。据报道，通过改进Ad载体，在血友病小鼠，BOD-FⅧ的表达时间可持续13周以上。最近，Alemany[14]等第一次构建FⅧ微小腺病毒载体，用2.5kb的人白蛋白基因片段作启动子，转移全基因组的人FⅧcDNA表达盒，将该载体注射到血友病鼠后，血浆中可产生300ng/ml的FⅧ表达量，并且在40ng/ml的水平上可维持6周。
八、腺病毒介导的其它基因转移
基因治疗适合于治疗一些单基因遗传疾病。鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC）缺乏症和苯丙酮酸尿症（PKU）是另外两类Ad介导的基因转移方法病例。OTC缺乏症是一种伴X染色体的氨基酸缺乏疾病，能影响尿素的生物合成而导致尿素症。Morsy等[15]在OTC缺乏症小鼠体内小外活体试验，证实了Ad介导的基因转移方法能引起OTC的有效表达，这项研究也给OTC缺乏症病人的治疗带来了曙光。PKU是由于肝内苯丙氨酸脱氨酶（PAH）缺乏而造成的先天性代谢紊乱，可导致个人严重的精神障碍。含人PAH cDNA基因的重组Ad载体已经构建，并且导入到PAH缺乏的小鼠中。这些动物血中苯丙氨酸过多的症状完全可以在1周内恢复正常。遗憾之点是这种治疗的效果不能持续太久。
参考文献
Rosenfeld MM,et al.Science,1991;252:431
Lemarchand P,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:6482
Kochanek,et al.Keystone Gene Therapy Smyposium,1997
Kozarsky KF,et al.J Biol Chem,1994;269:13695
Kobayashi K,et al.J Biol Chem,1996;271:6852
Fisher KJ,et al,Virology,1996;217:11
Hauser X,et al.Am J Human Gen,1994;55:A47
Vircent N,et al.1993;5:130
Acsadi G,et al.Huan Gene Ther ,1996;7:129
Kochanek S,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93:5731
Smith T,et al.Nat Genet,1993;5:397
Dai Y,et al.Proc Natl Sci USA,1995;92:1401
Connelly S,et al.Hum Gene Ther,1996;7:183
Alkemany,et al.J Virology Method,1997
Morsy MA,et al.J Clin Invest,1993;92:1580
... |
