缺血性脑损伤脑内移植治疗研究进展与前景

关键词： 缺血性脑损伤 脑内移植 胚胎 转基因细胞

　　摘要　　脑移植已成为神经科学中令人注目的领域，采用脑内移植治疗缺血性脑损伤的实验研究已逐渐引起人们的关注，被视为治疗缺血性脑损伤很有希望的新途径、新策略。转基因细胞和细胞系的移植由于避开了胎脑移植的伦理和来源问题，已成为新的研究热点和方向。

　　自Thompson首次进行大脑皮质移植实验以来，脑移植经历了一个多世纪的发展，已成为神经科学中令人关注的领域。近年来，脑内移植治疗缺血性脑损伤的实验研究已十分活跃，并取得了很大进展[1-3]。在动物实验中，无论是胎脑组织移植还是转基因细胞移植，缺血性脑损伤的脑内移植治疗均显示出了较好疗效4-6]，为未来临床应用积累了实验资料。DNA重组技术和脑立体定向技术的发展，使得在未来的临床应用中，可通过建立和发展细胞系和细胞库，采用脑立体定向技术的方法，对受体脑进行几乎无损伤的多靶点注射移植和重复移植。

　　1. 胎脑组织、细胞移植

　　理想的供体组织及来源，一直是脑移植研究中的重要问题。尽管在未来脑内移植治疗中，胎脑组织可能因来源和伦理问题而应用受限[3，7]，但大量研究表明，胎脑组织具有抗原性低和能无氧代谢等特点，移植后易于成活，能继续生长、分化和表达组织所特有的各种受体[8]，并能与受体脑整合，可产生较好的治疗效果[2，4，6]，因此胎脑组织至今仍是脑内移植较为理想的的供体组织来源。

　　1.1治疗皮质、纹状体缺血性损伤

　　Jansen等[6]对新生期缺血缺氧性损伤大鼠进行了胚胎皮质细胞悬液移植治疗，尽管已损皮质细胞构筑未见明显重建，但免疫组织化学显示移植细胞明显呈现为与正常皮质细胞神经化学表型上的相似性，且移植细胞与受体脑之间建立了广泛的纤维投射，宿主动物的运动缺失得到了相应改善。Tillotson等[9]对皮质缺血性损伤后进行的脑内移植证明，移植的胎脑皮质组织块可以成活。Hadani等[10]的研究表明，移植细胞不仅能在皮质梗死灶周边，而且也能在皮质梗死灶中心成活。另有研究表明[11]，皮质梗死后梗脑内移植与优良环境结合起来可使神经功能得到了意想不到的改善。推测其机制可能为优良环境激活了各种营养因子的产生；但也有人推测[12]，优良环境可刺激和加强脑的可塑性。Goto等[13]还研究了移植后脑室内长期给予GABA激动剂muscimol能否通过挽救纹状体缺血性损伤大鼠宿主黑质部分网状系统神经元（sNr神经）不致越神经元死亡而促进纹状体黑质通路的重新形成。他们发现，移植鼠与未行移植的纹状体损伤大鼠相比：⑴有明显的从移植物至同侧黑质的轴突投射；⑵同侧黑质部分网状结构内存活神经元明显增加；⑶用muscimol的移植动物出现脱水吗啡诱导的转动行为者明显减少，而未用muscimol者则未见明显减少。这些结果提示，移植细胞的宿主靶神经元的保存可能促进了移植宿主脑-移植物纤维连接，进而导致神经功能恢复。

　　纹状体缺血性损伤后的脑内移植实验研究表明，移植物可以成活并与宿主脑发生整合，使宿主动物运动行为障碍得到改善[3，14]。这些实验结果提示，未来临床上应用脑骨移植治疗缺血性脑皮质、纹状体损伤具有可行性。

　　1.2治疗海马缺血性损伤

　　海马是全脑缺血最常见的易损区[1]。在临床上，海马的缺血性损伤常可由卒中、心肺脑复苏、及外伤、新生儿窒息、癫痫等多种病因引起，可出现相应的学习、记忆力功能障碍。大量研究[2，4，7]表明，移植物也能在缺血性损伤的海马内成活，并能与宿主脑整合，使已损神经环路得到重建，以阐明移植物与受体脑之间的整合和发挥效应的具体机制，观察移植物可能产生的不利效应。Masada等[15]比较了缺血后CAI区或门/齿状回区海马胎脑移植大鼠功能结果和形态学改变，用双侧颈总动脉闭塞和低血压制作缺血模型，缺血1周后，将胎鼠海马神经元移植至双侧背侧海马CAI区或门/齿回区，移植4周后，用水迷宫法连续检测大鼠行为5d,所有动物均经灌注固定进行形态学研究。结果表明，背侧海马CAI区移植与记忆和形态学恢复，移植至背侧海马CAI区的神经元的形态上与CAI锥体神经元相似，可被钙结合蛋白D染成阳性，相反移植至背侧海马门/齿状回区的移植物在形态上呈异质性，用钙结合蛋白D染色不浓。可见，缺血后将胚鼠海马神经元移植至背侧海马CAI区可有效促进记忆功能和形态的恢复.

2.转基因细胞和细胞系的脑内移植

　　近年来，随着DNA的重组技术和细胞生物学的发展，转基因细胞及细胞系移植已成为脑移植研究新的热点。尽管一些研究结果提供了胚胎CAI移植能促进全脑缺血后功能恢复的证据，但由于临床应用胚胎组织有些实践和伦理学问题，其应用仍受限[1]。Arnold等[16]提示，人海马细胞结构发育至少需要15周。大量研究正致力于发展非胚胎性供体组织来源。已有一新纪元与缺血性脑损伤相关的进展，特别是已开发出营养性移植物和具有灵活发育能力的祖细胞、前体细胞或干细胞移植物[1]。

　　丛脑缺血可诱导包括脑源性生长因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）和神经营养因子-3-（NT-3）在内的神经营养因子以及生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）合成的部位特异性增加。这些改变的时间过程和发布提示，它们在启动损伤和回路重建中起重要作用。给予合适的生长因子可增强细胞存活，特别是在CAI区，此区NGF不能上调，可能与对缺血易损有关。大量生长因子在缺血模型中具有神经保护作用。现已证明，脑室内注射胰岛素样生长因子1（IGF-1）、转化生长因子β1（TGF-β1）和NGF能减轻缺血缺氧或皮质血供中断后梗死[1]。将大分子物质给至合适位置是需要克服的主要问题，颅内灌注大分子物质可导致创伤或炎症反应，因此将转染过的能释放合适生长因子的载体细胞植入靶点是一种有效的替代途径。全脑缺血前7d，将遗传修饰过的能表达NGF的成纤维细胞植入海马CAI-CA2区可减轻海马CA1-CA2区细胞脱失[17]。用能释放NGF或其他保护性生长因子的聚合物包裹细胞也可作为移植的插入和稳定载体。Maysinger等[18]表明，包裹移植物可减轻皮质血供阻断后的损伤。将McKay及其同事开发的细胞系HiBs用NGF基因转染后，可作为神经营养因子的另一安全途径[1]。这些移植物能增加老年或损伤小鼠基底前脑胆碱能细胞体的大小和数量。

　　适合移植的干细胞或祖神经元细胞系的开发也正在进行之中，为了最有效利用之，这些细胞必须是条件永生性的（conditionally immortalised）[1]。例如，用温度敏感性癌基因如SV40大T抗原转染，可允许细胞在低于许可温度（330C）时快速增殖并可体外处理，一旦移植至非许可脑温（380C）环境中，细胞停止分裂而分化成成熟神经元或胶质细胞[1]。其次，这些细胞必须来自祖源（progenitor source），如神经上皮（NE）干细胞，具有多能性发育能力，以便能根据其移植进的宿主区域的信号而发育成不同类型细胞。祖细胞移植物至新生或成年大鼠皮质、海马或小脑均能发育成神经元或胶质细胞[1]。

　　Kershaw等[19]已鉴定出来自H-2Kb-tsA58转基因鼠神经上皮的条件永生细胞群（conditionally immortalised cells），它们在干扰素诱导性H-2Kb启动子的控制下表达突变型SV40大T抗原等位基因。在允许温度下（330C），这些细胞可在体外培养基中加了bFGF时较长时间表达nestin（祖细胞特征分子），可被溴脱氧尿苷（BrdU,正在分裂细胞特征分子）着色。然而一旦置于非许可温度（370C）并移去bFGF则BrdU标记细胞分化成多种类型细胞、一些细胞表达神经元和神经原纤维特征分子（神经元特异烯醇酶，RT97），一些细胞具有递质特异反应性，另一些细胞则表达胶质细胞特征分子GFAP。因此，这一细胞群包含有不同分化能力的祖细胞，这些细胞能对缺血环境发生反应，在这种环境中、生长因子、细胞因子、神经营养因子和它们的高亲和性受体均能促进移植物成活、分化和突触形成[1]。研究者们已将H-2Kb-tsA58转基因小鼠神经上皮细胞宿主动物产生了具有与胚脑细胞移植同样有效的移植效应，并认为这些永生性神经细胞系以及来源于神经的更重要的和更具具潜力的移植供体，并将有可能避免未来脑内移植使用胎脑供体所面临的伦理和来源短缺问题。

　　最近，Borlongan等[5]将培养的还原于人胚胎肿瘤细胞系的神经元（NT2N）移植至栓塞性大脑中动脉闭塞致短暂局灶性脑缺血大鼠脑内的生物学效应。移植后1-6个月，移植NT2N细胞并用免疫抑制剂治疗的缺血动物与接受大鼠胎小脑细胞移植或仅给赋型剂的缺血动物相比，被动躲避试验明显改善，不对称运动行为明显正常化。冷冻保存NT2N细胞移植物与新鲜NT2N细胞移植物相比，在免疫抑制大鼠脑内更具活力，更能促进免疫抑制和缺血动物行为的恢复。这些结果提示，在神经移植治疗中枢神经系统疾病时，异种移植和冷冻保存在作为克隆细胞系移植物来源的有效工具。NT2细胞系是Andrew等从一种人类畸胎瘤中分离出来的一种胚胎癌细胞系，来自这种细胞系的细胞经过用视黄醛酸处理后，可以分化成类似神经元样细胞，故称NT2N细胞。在Borlongan的移植试验中，NT2N细胞移植后宿主动物并没有显示任何不良反应，进一步提示一些经处理后的人类癌性细胞克隆系也将可能是一种重要的脑内移植供体。

3　问题与展望

　　脑内移植至今仍是神经科学的前沿，因此目前仍将面临着许多重要的难题，如移植的免疫问题，供体的来源问题，以及移植物是否能长期存活和与宿主的整合问题等。但基于目前脑内移植实验研究的进展，建立和发展永生性神经细胞系及神经干细胞，仍将可能是今后缺血性脑损伤以及其他脑内移植治疗研究的重要方向。随着这些用于脑骨移植治疗的细胞系和细胞库的建立，将脑内移植与药物的保护治疗相结合，脑血管病的治疗也许将不再是一个难题。