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| 中药复方962胶囊对老年大鼠海马区神经生长因子及其受体表达的影响 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 文章来源：医学全在线 更新时间：2006-6-14 2:11:54 技能论坛 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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摘 要 目的：在老年性痴呆的发病中，年龄是最主要的危险因素，随年龄增长，发病率显著增高，自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：中药复方962胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药)能显著改善老年大鼠学习记忆功能。本研究观察中药复方962胶囊对自然衰老大鼠模型海马CAI—CA4区神经生长因子(NGF)及其受体TrK A表达的影响，探讨中药复方962胶囊治疗改善学习记忆功能的作用机理。方法：雌性Wistar大鼠老年为22月龄，青年为5月龄。阳性对照药为脑复康(piracetam)0.56g/kg，中药复方962胶套高剂量1.8g／kg，962胶囊低剂量0.9g／kg，每日灌胃给药一次，连续灌胃2个月，进行学习记忆实验(水迷宫)和旷场分析后，每组随机选取5只，灌注固定，冰冻切片，片厚40μm，每份标本均ABC法行NGF和TrK A免疫组化染色。采用法国Noesis Vision公司VISILOG5.0图象分析系统对组织切片进行分析。显微镜放大倍数为10×10，在海马CAl区锥体细胞层连续摄取3个视野，这三个视野包括了整个CAl区，记数3个视野内总阳性细胞数量、 阳性细胞总面积(象素单位)及阳性细胞灰度积分值(灰度单位)。海马CA2区连续摄取2个视野，海马CA3区连续摄取2个视野，海马CA4区摄取齿状回包含的1个视野，包括了整个CA2、CA3、CA4区。数据用均数±标准差表示(M±SD)，结果采用t检验。结果：①老年大鼠海马CAl、CA2、CA3、CA4区NGF表达较青年对照明显减少，阳性细胞数量为青年对照的19.89％，11.46％，6.65％和26.32％；阳性细胞总面积为青年对照的13.97％，6.76％，5.19％和25.01％；阳性细胞灰度积分值为青年对照的41.05％，35.49％，16，74％和29.17％。海马CAl、CA2、CA3、CA4区神经生长因子受体Trk A表达较青年对照也明显减少，阳性细胞数量为青年对照的12.42％，7.07％，9.26％和29.33％；阳性细胞总面积为青年对照的7.61％，4.92％，5.62％和23.79％；阳性细胞灰度积分值为青年对照的29，30％，18.70％，17.51％和34.19％。以CA2、CA3区的减少最严重。⑦中药复方962胶囊和脑复康均能提高老年大鼠海马CAl一CA4区NGF和Trk A阳性细胞数量、阳性细胞总面积和阳性细胞灰度积分值，962胶囊高剂量组基本恢复青年对照组水平。结论：老年大鼠神经生长因子(NGF)及其受体Trk A在海马区表达明显减少，可能与其学习记忆能力下降有关；中药复方962胶囊能够明显促进老年大鼠海马区NGF及受体TrK A表达，可能是改善其学习记忆功能的药理学基础。增强内源性神经营养物质的表达对老年性疾呆的治疗有重要意义。 前 言 老年性疾呆(Alzheimer’s disease。AD)是一种老年神经退行性疾病，临床以进行性记忆障碍和后天获得性知识丧失为特征，原因不明，尚元有效的治疗方法。自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：我室自行组方并研制的新复方962胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药)能显著改善老年大鼠学习记忆功能。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在调节神经元生长和存活方面起着重要作用，AD过程中神经元的丢失至少部分是由于神经营养因子的缺乏。本文观察自然衰老大鼠脑内是否发生神经生长因子(NGF)及其受体Trk A表达的变化，以及962胶囊对内源性NGF及其受体Trk A表达的影响，探讨962胶囊改善学习记忆功能的作用机理。 材料和方法
2 动物： Wistar大鼠雌性，老年大鼠为22月龄(体重330±32g)，青年为5月龄(体重325±19g)。购于北京医科大学动物中心，动物证号：医动字01—3056。 3 试剂与主要仪器： ABC试剂盒、神经生长因子(NGF)兔抗鼠抗体、酪氨酸蛋白激酶受 体A(Trk A，主要为NGF的受体)兔抗鼠抗体均购自北京中山试剂公司；恒温冷冻切片机为英国山盾公司ASE—620型，光学显微镜为NikonTE300型，图象分析系统为法国NoesisVision公司VISIUG5.0。 4 方法： 表1 大鼠分组给药情况
注：962胶囊成人临床用量：7.5g／60kg／日
(2)脑标本的免疫组化染色：每组随机选取5只，灌注固定，冰冻切片，片厚40μm，为冠状切面前囱后—4.4mm。PBS洗5分钟×3次，3％H202室温孵育10分钟，PBS洗5分钟×3次；8—10％封闭用羊血清孵育20分钟，吸出，加稀释好的一抗4℃过夜(一抗稀释度：NGFl：120，TrkAl：120)；PBS洗，加生物素化的兔二抗(1：200稀释)室温放置3小时3PBS洗，加辣根过氧化物酶标记的三抗(1：250稀释)孵育2小时；PBS洗，DAB显色2分钟，镜下控制染色程度；Carriz浅复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照设立；分别以洗液和非免疫的正常鼠血清代替一抗进行免疫组化染色，余步骤同前。阳性反应为组织细胞结构呈棕黄色颗粒聚集。
(3)图象分析处理：采用法国NoesisVision公司VISII。OG5.0图象分析系统对组织切片进行分析。显微镜放大倍数为10×10。在海马CAl区锥体细胞层连续摄取3个视野，这三个视野包括了整个CAl区，记数3个视野内总阳性细胞数量、阳性细胞总面积(象素单位)及阳性细胞灰度积分值(灰度单位)。海马CA2区连续摄取2个视野，海马帜3区连续摄取2个视野，海马CA4区摄取齿状回包含的1个视野，包括了整个CA2、CA3、CA4区。
(4)统计学处理：本研究均使用SPSS软件进行分析，数据用均数±标准差表示(M±SD)， 结果采用t检验。
实验结果
1 中药复方962胶囊对老年大鼠海马CAl一CA4区神经生长因子(NGF)表达的影响
结果见表2。青年对照大鼠海马CAl一CA4区NGF阳性神经元分布较多，老年大鼠模型组海马区NGF阳性神经元数量、阳性细胞面积及阳性细胞灰度积分值与正常青年对照组相比均显著减少；图象分析结果表明，老年大鼠阳性细胞数量在CAl一CA4区分别为青年对照的19.89％， 11.46％，6.65％和26.32％；阳性细胞总面积为青年对照的13.97％，6.76％，5.19％和25，01％阳性细胞灰度积分值为青年对照的41.05％，35.49％，16.74％和29.17％，其中老年大鼠海马CA2、CA3区NGF的表达减少最严重。962胶囊与脑复康给药组老年大鼠，海马CAl一CA4区NGF阳性神经元数量、阳性细胞面积及阳性细胞灰度积分值有不同程度的增加。962胶囊大剂量组(1.8g，kg)老年大鼠海马各区的NGF阳性神经元基本恢复青年对照水平，阻性细胞数量是未用药模型组的4.5，5.1，9.7和3.4倍；阳性细胞总面积为模型组的7.6，9.8，12.5和4.0倍；阳性细胞灰度积分值为模型组的1.9，2.5，6.8，3.7倍，962胶囊对老年大鼠海马CA2、CA3区NGF的表达增加作用最明显。 表2 962胶囊对老年大鼠海马CAl一CA4区神经生长因子(NGF)表达的影响
n＝5，x±s， 与老年模型组比较， * P＜0．05， ** P＜0．01， *** P＜0．001，
2
2 中药复方962胶囊对老年大鼠海马CAl—CA4区神经生长因子受体Trk A表达的影响
结果见表3。老年大鼠模型组海马CAl一CA4区神经生长因子受体TrkA阳性神经元显著少于青年对照组，阳性细胞数量分别为青年对照的12.43％，7.07％，9.26％和29，33％5阳性细胞总面积为青年对照的7.61％，4，92％，5.62％和23.79％；阳性细胞灰度积分值为青年对照的29.30％，18.70％，17，51％和34，19％。962胶囊与脑复康有增加的作用。962胶囊大剂量组(1.8g／kg)促进老年大鼠海马各区Trk A表达的作用最显示，阳性细胞数量是末用药模型照的4.1，9.6，8.2和2.6倍；阳性细胞总面积为模型组的6.1，12.8，14，3，3.5倍；附性细胞灰度积分值为模型组的2.2，4，9，5.4，1.1倍，962胶套对老年大鼠海马CA2、CA3区T山A表达的增加作用最明显。 表3 962 胶囊对老年大鼠海马CAl—CA4区Trk A表达的影响
结论与讨论
海马区根据细胞结构的不同分为CA1、CA2、CA3、CA4四个区域，它们都与学习记忆密切相关，但在功能上略有不同。CA2、CA3区是学习记忆的中心区，而CAl、CA4区是学习记忆的周边区。我们的研究发现：老年大鼠海马CAl、CA2、CA3、CA4区NGF表达均较青年对照明显减少，但老年大鼠海马CA2、帜3区NGF的表达减少更严重，与学习记忆的功能分区相一致是造成老年大鼠学习记忆障碍的主要原因。 侧脑室内注射NGF可减少切断隔海马径路或穹窿伞引起的胆碱能神经元退变，老龄大鼠注射NGF可提高胆碱乙酰化转移酶的水平，改善认知及记忆功能，因此NGF治疗AD有理论根据。文献报道脑室内灌注NGF(1—3个月)治疗AD病人3例，出现语言插曲记忆改善，额、颞皮层烟碱结合增加，脑血流增加，说明NGF的治疗意义。然而，外源性NGF价格昂贵，分子量大不易通过血脑屏障，具有严重的副作用(包括体重减轻、疼痛和精神错乱)，并不是理想的治疗方法。因此增加内源性NGF的合成和释放，成为研究AD治疗的重要内容。 962胶囊是我室自行研制开发的中药新药，目前，已完成临床前药效及毒理研究。我们以往的实验证明：962胶囊能显著改善老年大鼠学习记忆功能。本实验发现，在与学习记忆密切相关的海马CAl—CA4区锥体细胞层，962胶囊能明显促进自然衰老大鼠神经生长因子(NGF)及其受体(Trk A)表达，说明其可能含有或导致体内产生能通过血脑屏障的某些小分子物质，促进内源性NGF及其受体合成和释放。962胶囊对学习记忆的中心区一海马CA2、CA3区NGF和Trk A表达的增加作用最强，这一药理基础是其改善老年大鼠学习记忆功能的重要机制，对于保护和修复神经元，防治AD等神经退行性疾病具有重要意义。 |
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