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（五）高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）法的种类很多，应用也十分广泛，现将生化药物中常用的方法概述如下。
1．反相高效液相色谱法（RP－HPLC）以（C4、C8、C18）烷基硅烷键合相为柱填料，以甲醇-水、乙腈-水或甲醇、乙腈与缓冲液构成的溶液为流动相，以紫外、荧光或电化学检测器为检测手段，这种色谱体系在生化药物（例如肽类、氨基酸、蛋白质、多糖等）定量分析中应用广泛。例如：生白能（leucomax）的含量测定就是采用RP－HPLC法。
本品系基因工程药物。它的活性成分为重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（γHUGM·CSF），是一种调节造血和白细胞功能所必须的蛋白质。含量测定方法如下。
磷酸缓冲液的配制：称取Na2HPO43.55g，加水400ml，溶解后用稀磷酸调pH至7.0，加水至500ml，摇匀。
供试品及对照晶溶液的配制：精密称取供试品或对照品适量，用上述磷酸盐缓冲液配制成300μg／ml的溶液即可。
仪器与色谱条件：岛津HPLC仪（LC10A）。色谱柱规格为15cm×4．6mm，柱填料为TSK ODS120T（5μm）柱温：室温；检测波长：214nmz流动相：A液为0．1％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈－1％三氟乙酸水溶液（90：10）；梯度洗脱：
（表）
流速：1.0ml／min。在上述条件下依次注入对照品、样品溶液各20μl作HPLC分析，其色谱图见图。
计算方法按峰面积外标法计算。本品含量应为标示量的85.0～110.0％。
本法准确度高（回收率大于98％），精密度好（RSD小于2％）。tR21.236min的峰为生白能的主成分，tR13.639min的峰为人血白蛋白（生白能的添加剂），主成分与添加剂的分离度R＞2.0。
本法采用梯度洗脱，使主成分与添加剂的分离十分完全。流动相中加入三氟乙酸，增大了对蛋白质的洗脱力，且使主成分峰形尖锐、对称。
2．高效离子交换色谱法（HPIEC） HPIEC是蛋白质、多肽分离分析中常见的方法之一。HPIEC具有以下特点：
1）蛋白质、多肽的分离是根据其相应的离子化程度而进行的。暴露在外的带电荷的氨基酸残端的数量（如天冬氨酸、赖氨酸）将影响洗脱过程。
2）分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱法进行的。样品液必须和进样前的流动相保持相同的pH和离子强度。为获得良好的重现性，样品进样前，柱必须充分平衡。典型的分离梯度是缓冲液为0.3～1.0mol／L的盐溶液。如有可能应尽量避免使用卤素类盐以延长不锈钢柱的寿命。
3）柱效中等并具有较高质量的活性回收。虽然获得的峰比反相色谱更宽，但活性回收更佳。活性蛋白质的回收可通过不同强弱交换类型的选择而优化。对于一些敏感蛋白质，如果回收有问题，弱型离子交换剂可获得更好的活性和质量回收。 医学.全在.线www.med126.com
（3）高效凝胶过滤色谱法（HPGFC） HPGFC可用于多肽和蛋白质等生化药物的分离及其分子量的测定。HPGFC柱上填充着微粒状的具有亲水性表面组成的有机物载体或表面性质得到改造的硅胶类物质。HPGFC有如下优点：
1）活性蛋白质可得以回收。填料和样品间的相互作用在所有的液相色谱技术中，本法是最温和的。因此，活性蛋白质几乎可以全部回收，除非流动相中含有变性剂，如尿素等。
2）分离是在固定比例的水溶液中进行的。流动相通常为缓冲液。为了提高分离能力，可加入少量的能与水互溶的有机改性剂或表面活性剂。
3）分离是根据蛋白质．或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的。当蛋白质具有相同的形状（如球状或纤维状）时，通常可以根据分子量来预示组分的洗脱顺序，故可用来测定蛋白类药物的分子量。
例如：用HPGFC法测定重组人肿瘤坏死因子（rh－TNF）衍生物的分子量，现介绍如下。
rh-TNF属基因工程药物，其分子量的测定是该药质量控制的主要指标之一。
仪器与色谱条件：岛津LC－10A HPLC仪；色谱柱：Beckman Ultraspherogel SEC3000（30cm×7.5mm）柱；流动相为0.1mmol／L KH2P04：0.1mmol／L Na2S041：1）＋0.05％叠氮化钠，流速1ml／min；检测波长为280nm。
标准蛋白分子量曲线的制备选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成混合标样。考虑到流速等因素对保留时间T的影响而选用了内标法，即在混合标样中加入右旋糖苷蓝和酪氨酸作为内标，进样后可同时测得完全排阻和完全进入填料孔隙的两种内标的保留时间To和Tt，用分配系数（kd）对分子量对数（lgM.W.）作图，从而保证测定结果有较好的重现性。结果见表图
（表图）
样品测定根据样品的保留时间T求出其分配系数（公式）由从标准蛋白分子量曲线上查出相应的lgM.W．，计算出分子量。测定了3个厂家的7批rh－TNF 衍生物样品，其中3批分子量为45000，提示其天然活性成分形式可能是三聚体；而其他4批分子量为36000，提示其天然活性成分形式可能是二聚体。
（标准蛋白色谱图）
HPGFC法测定蛋白质分子量，具有快速、准确、重现性好、简便易行、样品用量少（微克级）等优点，是一种测定蛋白质分子量的重要方法。
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