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3）分离后测定：
（1）柱色谱法：如维生素K1注射液的测定方法，中国药典（1985版）采用三甲基戊烷提取后，将提取液经过含7%水的中性氧化铝色谱柱，以乙醚-三甲基戊烷（1：49）洗脱，流速约1ml/min，收集洗脱液后，于249nm波长处测得吸收度，按吸收系数（E1 m）为420计算，即得。（90版后改为HPLC法）
丙酸睾酮注射液的含量测定可采用反相分配柱色谱法，若油溶剂中含甾醇和三萜类杂质较多时，可选用一反相柱A和一正相柱B串联的形式，其柱系统如下：
A B
支持剂 硅烷化硅藻土（极性小） 硅藻土（极性大）
固定相 正庚烷（用95%乙醇饱和） 硝基甲烷
流动相 95%乙醇（用正庚烷饱和） 正庚烷
测定时，量取相当于50mg丙酸睾酮的注射液，注入A柱中，则溶剂油被滞留在A柱上，经流动相洗脱，丙酸睾酮、甾醇及三萜类将被洗脱下来；然后将洗脱液流入B柱，用正庚烷洗脱，此时，甾醇和三萜类杂质滞留在B柱上，丙酸睾酮被洗脱于正庚烷中。将正庚烷洗脱液用95%乙醇稀释后，用紫外分光光度法进行测定。
若油溶剂中含甾醇和三萜类杂质很少时，可用一根反相柱，将供试品注入后，以95%乙醇洗脱，油溶剂滞留在A柱上，紫外分光光度法测定。（USP21）测定丙酸睾酮油注射液用此法。
（2）高效液相色谱法：药典对一些甾体激素类药物的油注射液，如丙酸睾酮注射液、苯丙酸诺龙注射液、维生素E注射液、及黄体酮注射液等，均采用HPLC法测定。
黄体酮测定方法如下：
色谱条件：用碳十八烷基硅烷键合硅胶为填料的分离柱，以甲醇-水（70：30）的混合液为流动相，流速1ml/min，于254nm波长处检测，理论塔板数按黄体酮的峰计算应不低于600，黄体酮与内标物的分离度应符合要求。 医学全在线网站www.lindalemus.com
校正因子的测定：取黄体酮对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。另取己稀雌酚约18mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标溶液。精密量取对照品溶液和内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；取5~10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱
图，按下式计算校正因子供试品溶液的制备与测定：用内容量移液管精密量取本品适量（约相当于黄体酮50mg），置 50ml量瓶中，用乙醚分数次洗涤移液管内壁，洗液并入容量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml置具塞离心管中，在温水浴中使乙醚挥散，用甲醇振摇提取4次（第1~3次各5ml，第4次3ml），每次振摇10分钟，离心15分钟，并用滴管将甲醇液移至25ml量瓶中，合并提取液，精密加入内标溶液（己烯雌酚）5ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀；取5~10μl注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，按内标发以峰面积计算即得。
上述操作中，选用乙醚作溶剂的原因使黄体酮和溶剂油均易溶于乙醚中，这样可准确的量取供试品，同时也易于挥散；黄体酮易溶于甲醇，而油溶剂则不溶，因此，选用甲醇将黄体酮提取分离后进行测定，溶剂油的干扰就被排除了。
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